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聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE膠的制備過程

時間:2014-6-27閱讀:584
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聚丙烯酰胺凝膠電泳 可用于蛋白和寡核苷酸的分離,zui常用于蛋白質的分離,這里總結了DNA電泳的各種濃度PAGE膠配制的配方及制備方法。

聚丙烯酰胺 凝膠電泳簡稱為PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉雙丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N'-methylenebisacrylamide)聚合而成,這一聚合過程需要有自由基催化完成。

各種濃度PAGE膠的配制(DNA電泳用)

50ml體系:

丙烯酰胺有效分離(bp)二甲苯青溴酚藍丙烯酰胺30%(ml)10×TBE(ml)ddH2O(ml)TEMED(µl)過硫酸銨10%(µl)
3.5%100-10004601005.83539.1725.0250
5.0%100-500260658.33536.6725.0250
8.0%60-4001604513.33531.6725.0250
12.0%40-200702020.0525.0025.0250
15.0%25-150601525.0520.0025.0250
20.0%5-100451233.33511.6725.0250

5ml體系:

丙烯酰胺丙烯酰胺30%
(ml)
10×TBE
(ml)
ddH2O
(µl)
TEMED
(µl)
過硫酸銨10%
(µl)
3.5%0.5830.53.9172.525
5.0%0.8330.53.6672.525
8.0%1.3330.53.1672.525
12.0%2.000.52.52.525
15.0%2.500.52.02.525
20.0%3.3330.51.1672.525

1、丙烯酰胺30%為29:1(質量比,丙烯酰胺:雙甲叉丙烯酰胺)

2、TEMED 可以加到1ul/ml。

不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍表

丙烯酰胺(%)有效分離范圍(bp)溴酚蘭*二甲苯青*
3.5100~2000100460
5.080~50065260
8.060~40045160
12.040~2003070
15.025~1501560
20.010~1001245

*表中給出的數字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子 所含堿基對數目(bp).

凝膠的制備過程:

1、 按要求裝配好垂直電泳板,兩塊玻璃板的兩側及底部用1%的瓊脂糖封邊,防止封閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出。

2、 將裝好的玻璃電泳板傾斜成45~60℃角。

3、 按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數。

4、 加入TEMED后,立即混勻,緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中,直到液體接近溢出時為止。

5、 立即插入適當的梳子,密切注意防止梳齒下產生氣泡,用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上,然后將玻璃板斜靠在物體上,使成10°角,可減少液體泄漏的機會。

6、 室溫聚合一小時后,將玻璃板插入電泳槽中,上緊,倒入0.1XTBE緩沖液。

7、 小心取出梳子,加樣。

大家可以根據自己試驗中DNA片段大小的不同選擇配制合適濃度的丙烯酰胺膠。PAGE膠配制過程中記得避免氣泡的產生。

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