（1）將抗原共價(jià)結(jié)合到固相支持物上zui簡單的方法，是將抗原結(jié)合到活化的微球上。現(xiàn)有商家提供各種不同的支持物。這些活化的基質(zhì)的應(yīng)用將于第九章討論。如果必須使用這些基質(zhì)，首先推薦使用有彈性空間臂的基質(zhì)。它能保證結(jié)合抗原的活性位點(diǎn)與微球自身之間合適的距離。
如果使用多肽抗原，應(yīng)將抗原直接連接到活化微球上。
如果使用多肽抗原，將其直接連接到微球上，而不是將它先連接到一載體分子上。如果合成肽在其一端有自由氨基或羧基基團(tuán)，通過此基團(tuán)將肽直接連接到微球上。在個(gè)別情況下，合成肽不具有這些基團(tuán)，這種肽應(yīng)通過與制備抗原相同的方式將它們連接到載體分子上。這些載體分子必須不同于那些用于免疫的載體分子（例如可以用BSA—肽純化針對KLH—肽產(chǎn)生的抗體）。否則，針對載體分子的抗體也將被純化。盡管任何分子在理論上都能用作載體，但建議純化抗體時(shí)的載體選用與制備抗體時(shí)使用的載體類似的大分子蛋白質(zhì)。
抗體樣本的緩沖液中不能有外源性的化合物，它們能與活化微球的反應(yīng)基團(tuán)結(jié)合。zui常見的結(jié)合過程是針對抗體上的氨基基團(tuán)（或琉基，如果用氯化甲苯磺酰）。如果在抗體純化時(shí)已用過這些化合物，抗體樣本應(yīng)用0．5mol／L磷酸鈉結(jié)合緩沖液（pH7．5）充分透析。
（2）用0．5mol／L的磷酸鈉溶液（pH7．5）制備抗原溶液。留小量樣品以檢測結(jié)合率（將在第5步中進(jìn)行）。待結(jié)合的抗原量依不同的實(shí)驗(yàn)而異。在多數(shù)情況下，10mg的抗原加到lml的微球上將得到高容量柱。
同所有蛋白質(zhì)溶液一樣，應(yīng)避免過度的機(jī)械作用或與空氣接觸以盡量避免蛋白變性。
（3）加入根據(jù)廠家推薦的方法準(zhǔn)備好的活化微球。
（4）用搖床在室溫下輕柔混勻2h或4℃過夜。
（5）用0．5mol／l磷酸鈉溶液（pH7．5）洗滌微球2次，收集過夜結(jié)合的上清液。比較緩沖液中前后蛋白的含量。如果抗原有*、*或苯*殘基，可比較其280nm處的吸光度值。也可用考馬斯亮藍(lán)染SDS-PAGE后的條帶。
（6）用lmol／L氯化鈉溶液和0．05mol／L磷酸鈉溶液（pH7．5）洗滌微球一次。
（7）加入10倍體積的100mol／L乙醇胺（pH7．5），室溫下孵育4h或4℃過夜，輕輕搖勻。
（8）PBS洗2次。
（9）將結(jié)合有抗原的微球裝柱。有些結(jié)合的抗原可能在洗脫抗體時(shí)亦被洗脫，預(yù)洗滌時(shí)，去除這些抗原非常重要。在本例中，抗體即能在低pH值，又能在高pH值時(shí)釋放出來，所以要用這些緩沖液對抗原柱進(jìn)行預(yù)洗滌。
先用10倍微球體積的10mmol兒Tris（pH7．5）溶液洗柱，再用10倍微球體積的100mmol／L*（pH2．5）洗滌，然后用10倍體積的10mmol／L Tris（pH8．8）洗脫。檢測zui后出柱的Tris洗液的pH值。如果不是8．8，繼續(xù)洗滌。接著加入10倍體積100mm01／L三乙胺（pHil．5，新鮮配制）。用10mmol／LTris洗滌直至洗液的pH值達(dá)到7．5為止。
（10）將多克隆血清過柱，使抗體與柱上的抗原結(jié)合。血清上柱前應(yīng)無任何沉淀，如果有，應(yīng)通過離心或用蛋白A或蛋白G色譜柱（見前）純化抗體，以便除去沉淀。如果樣品是血清，上柱前用10mmol／LTris（pH7．5）將血清以1：10稀釋。抗體溶液過柱時(shí)應(yīng)用蠕動(dòng)泵使其以低流速過柱。
使用高pH和低pH溶液洗脫，只能洗脫出一部分結(jié)合到柱上的抗體。一些高親合力抗體在這些條件下仍不能被洗脫，因此zui終將導(dǎo)致抗體結(jié)合容量降低。如果遇到這種情況，又不能得到新層析柱，可以用更苛刻的試劑洗脫，如1．5mol／L硫氰酸鉀、4mol／L尿素或3．5mol幾氯化鎂，它們可能使層析柱再生，用來制備有用的抗體，但取決于抗體的性質(zhì)。
（11）用20倍微球體積的10mmol／LTris（pH7．5）洗滌柱，然后用20倍體積的500mmol／L氯化鈉，10mmol／LTris（pH7．5）依次洗脫。
（12）通過用10倍體積100 mmol／L*溶液（pH2．5）過柱，可以洗脫對酸敏感的抗體。將洗脫液收集在盛有1倍微球體積的1mol／LTris溶液（pH8．0）中。
（13）用10mmol／LTris（pH8．0）洗滌柱，直至pH值升至8．8。
（14）通過用10倍體積100mmol／L三乙胺溶液（pHll．5，新鮮配制）過柱，可以洗脫對堿敏感的抗體。將洗脫液收集在盛有1倍微球體積的lmol／LTris溶液（pH8．0）中。
（15）用10mmol／LTris（pH7．5）洗滌柱，直至其pH為7．5。將柱子存放于含0．01％柳硫汞的緩沖液中，以便以后重新使用。
（16）將各抗體溶液混合，并用含0．02％氯化鈉的PBS溶液透析。如果有必要，通過蛋白A或蛋白G柱濃縮抗體。