積層膠（或稱濃縮膠）的作用原理？
在緩沖系統(tǒng)中的弱酸，如*，在pH6.7時很少解離，其有效泳動速率很低，而氯離子卻有很高的泳動速率，蛋白質(zhì)的泳動速率介于兩者之間。加上電 壓以后，作為先導(dǎo)離子的氯離子和尾隨離子的*離子分離開來，并在其后面留下一個導(dǎo)電性較低的區(qū)帶。由于導(dǎo)電性和電場強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便獲得較高的 電壓梯度，加速*離子的泳動，使其趕上氯離子，建立起*和氯離子的電壓梯度和泳動速率乘積相等的穩(wěn)定態(tài)（我不太明白這句話），使這些帶電顆粒以相 同的速度泳動，兩種離子之間有明顯的邊界。當(dāng)*、氯離子界面通過樣品進(jìn)入濃縮膠時，在移動界面前有一低電壓梯度，界面后有一高電壓梯度。由于在移動界 面前的蛋白質(zhì)分子泳動速率比氯離子低，因此氯離子能迅速越過。移動界面后的蛋白質(zhì)處于較高的電壓梯度中，其泳動速率比*快。因此，移動的界面將蛋白質(zhì) 分子堆積到一起，形成一條狹窄的區(qū)帶。蛋白質(zhì)在移動界面中的濃度作用僅取決于樣品和濃縮膠中Tris-HCl的濃度（為什么？），而與樣品中蛋白質(zhì)的zui初 濃度無關(guān)。由于濃縮膠為大孔凝膠，故對蛋白樣品沒有分子篩作用。當(dāng)移動的界面到達(dá)濃縮膠和分離膠的界面時，凝膠的pH明顯增加，導(dǎo)致*大量解離。此 時，*的有效泳動速率明顯增加，超越蛋白分子，直接在氯離子后移動。由于凝膠孔徑變小，蛋白質(zhì)分子的遷移速率降低，落在后面的蛋白質(zhì)便在均一的電壓梯 度和pH環(huán)境中泳動，并根據(jù)其固有的電荷與分子大小進(jìn)行分離。
1. 配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？

在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－*緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此*解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導(dǎo)電性與電場強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，*大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。

　所以，pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。

2. 樣品如何處理？

　　根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。

1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。

2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。

3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。

3. SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？

　聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；

制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統(tǒng)，

　　TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進(jìn)行；　　十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。

4. 提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？

　聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

　　一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊》P82-103。

5.“ 微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？

  主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。

處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6. “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？

　　主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。

處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。  S1 R) b( |8 L

7. 為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？

　主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。" h) R3 l6 |" P! }

處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。(

8. 為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？

　　主要是樣品不溶性顆粒引起的。

處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。

9. 什么是“鬼帶”，如何處理？

　“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。8 N/ p5 D( B, Y9 M, u* |* Z

處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。

10. 為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？

　我們在實(shí)驗(yàn)中常會遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。

處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。

1. 為什么電泳的條帶很粗？

　電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。

處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當(dāng)降低電壓；

2. 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？

　這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。) g9 p/ P& r" S1 [$ u. u. E

處理辦法：電泳槽正確裝配即可。、

3. 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？

　這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。"

14. 凝膠時間不對，或慢或快，怎么回事？

通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。

15. 電泳時間比正常要長？

　　可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高。