1）-10℃甲醇溶液5min，自然干燥（推薦方法）；或

2）冰丙酮2min，自然干燥；或

3）1%甲醛-PBS 10min（保持濕潤）。

PBS洗三次。

可選擇：含0.1-1%過氧化氫的PBS孵育5-10min，淬滅內源過氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。

95%乙醇清潔玻片，涂一薄層黏附劑，自然晾干。或使用預處理的玻片。

切片厚度4-10μm。室溫貼片。切片保存在-70℃。固定染色前室溫解凍切片。

可選擇：含0.1-1%過氧化氫的PBS孵育5-10min，淬滅內源過氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。

注意：組織內有豐富的*（引起高背景染色），建議甲醛固定，遵循石蠟包埋組織切片protocol，因為石蠟包埋組織中內源性*被破壞。

95%乙醇清潔玻片，涂一薄層黏附劑，自然晾干。或使用預處理的玻片。

切片厚度4-6μm。二甲苯脫蠟，3次，5min/次。依次過梯度酒精水化：100%乙醇，2次，10min/次，95%乙醇，2次，10min/次。去離子水浸洗1min。甩去切片上多余的液體。

*：切片用含0.1%*的0.01N HCl室溫孵育10-20min。去離子水沖洗幾次，甩去多余液體。

皂角苷：切片用含0.05%皂角苷的去離子水室溫孵育30min。PBS至少洗3次，甩去多余液體。

所有反應步驟均于室溫下濕盒內完成。使用前試劑盒試劑要先恢復至室溫。操作中切片不能過干。每步操作完用吸引管吸除試劑，避免切片過干。要用足夠的反應液覆蓋標本（通常100μl/張切片就足夠了）。

滴加*抗體室溫孵育30min或4℃過夜孵育。抗體*反應濃度需經滴定確定；建議用含1.5%封閉血清的PBS稀釋至0.5-5.0μg/ml。PBS洗3次，5min/次。

滴加預稀釋的*化第二抗體或用含1.5%封閉血清的PBS稀釋至1μg/ml的*化第二抗體，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。

滴加親和素*酶反應物，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。

用提供的過氧化物酶底物孵育30s-10min或直至出現理想染色止。注意監控單張切片的恰當顯色時間。去離子水洗5min。可用蘇木素（sc-24973）復染5-10s。迅速用去離子水洗幾次。

 梯度酒精，二甲苯依次脫水：浸沒入95%乙醇2次，10s/次，然后100%乙醇2次，10s/次，zui后二甲苯3次，10s/次。擦掉多余的二甲苯。迅速加1-2滴封片固定劑（如Clarion，sc-24942），蓋上蓋玻片（sc-24975），光學顯微鏡下觀察。

迅速加入1-3滴預稀釋的*抗體。如果所用染色系統不含預稀釋的抗體，就把*抗體用血清封閉液稀釋至0.5-5.0μg/ml。孵育2hrs。PBS沖洗，然后切片浸沒入PBS內洗2次，2min/次。甩去多余的液體。

滴加1-3滴*化第二抗體，孵育30min。清洗同上步。

滴加1-3滴HRP-鏈親和素復合物，孵育30min。清洗同上步。

滴加1-3滴HRP底物混合物。顯色30s-10min，或直至出現理想染色止。去離子水沖洗，然后切片浸沒入去離子水內洗2次，2min/次。

復染，脫水，封片。（同ABC染色試劑盒）