2500rpm（約1000×g），4℃離心30s。轉移上清（細胞溶解物）至干凈的微量離心管。

1ml細胞溶解物或約100-1000μg總細胞蛋白，加入10μl*抗體瓊脂糖偶聯物，混勻，4℃孵育1hr-過夜。

可選擇：如無*抗體瓊脂糖偶聯物，1ml細胞溶解物加入1-10μl（如0.2-2μg）*抗體（抗體濃度應滴定測定），4℃孵育1-2hrs。加入20μl適當的瓊脂糖偶聯物懸浮液（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。蓋好管子，4℃振搖孵育1hr-過夜。

2500rpm（約1000×g），4℃離心30s，收集免疫沉淀物，小心吸棄上清。

用1.0ml RIPA裂解緩沖液或PBS輕輕洗滌沉淀2-4次，每次重復以上離心步驟。

zui后一次洗滌后，小心吸棄上清，用40μl 2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）重懸沉淀。

樣品煮沸2-3min。0.75mm×1.0mm的上樣孔上樣5-10μl。

電泳并按WB程序作免疫雜交。

從100mm細胞培養皿（單層細胞80-90%匯合）移除培養基，PBS洗一次。

加入1-3ml冰預冷的RIPA裂解緩沖液（sc-24948），4℃孵育10min。（注意：RIPA裂解緩沖液對某些激酶效果不好。需要優化裂解液成分來保持激酶活性。）

用21號注射器針頭反復抽吸使細胞破碎充分，轉移至15ml離心管中。

用1ml冰預冷的RIPA裂解緩沖液，0.5%Triton X-100（sc-29112）沖洗培養皿，與原裂解液合并。

10000×g，4℃離心10min。4℃轉移上清至新的離心管內。

轉移1.0ml細胞提取物（上清）至1.5ml離心管中。加入1-10μl（0.2-2μg）*抗體（抗體*濃度經滴定測定），4℃孵育1hr。

加入20μl適當的瓊脂糖偶聯物懸浮液（（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。蓋好蓋子，4℃振搖孵育1hr-過夜。

2500rpm（約1000×g），4℃離心5min，收集免疫沉淀復合物。小心吸棄上清。

1.0ml /次RIPA或PBS洗沉淀4次，每次重復上述離心步驟。

20μl適當的蛋白激酶緩沖液重懸沉淀（如50mM HEPES（sc-29097），0.1mM EDTA（sc-29092），0.01%BRIJ 35（sc-29087）），0.1mg/ml BSA，0.1% β-巰基乙醇（sc-29086），0.15M NaCl（sc-29108）。緩沖液成分根據所研究的激酶調整。

加入10-1000ng多肽底物。該底物/酶/細胞系的多肽底物濃度應根據經驗決定。

準備1ml ATP混合物：930μl適當的蛋白激酶緩沖液，6μl 50mM ATP，pH7.0，20μl 2.0 M MgCl₂和44μl [γ³²P]-ATP[10mCi/ml]。每個樣品加入10μl ATP混合物，30℃孵育30min。冰上放置。

加入等體積2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）終止反應，樣品煮沸2-3min。樣品可離心沉淀瓊脂糖微珠（可選擇）；分析上清。跑SDS-PAGE，通過放射自顯影觀察結果。未用完的樣品保存在-20℃。檢測中如用小肽底物，樣品必須通過閃爍計數或其他標準方法而不是SDS-PAGE來分析。