組織細胞microRNA提取試劑盒

描述：生產的組織細胞 miRNA 提取試劑盒是目前世界 上提取小 RNA（<200nt）操作步驟重復性、 小 RNA 產率的方法。使用該試劑盒提取的小 RNA （Small RNA）中，長度在 15～200nt 范圍的 RNA 在 95% 以上，基本不含有大 RNA 和 DNA。使用該試劑通過一步上 柱即可獲得高純度 miRNA，可在 45min 內完成小 RNA 的提 取。該試劑盒廣泛適用于動物組織、細胞和多糖多酚含量不 高的植物組織樣本。

儲存：室溫可保存 2 年。

使用防護建議：miRNA Reagent A 溶液中含有胍鹽，其具有 強烈的腐蝕性，試驗時請務必佩戴防護眼鏡、手套、口罩等 防護措施，如有皮膚接觸請立即用大量清水沖洗，再另行就 醫。
操作方法： 1. 組織樣本提取 (1) 向 1.5ml EP 管中加入 300μl miRNA Reagent A。植物組 織則再加入 10μl β-巰基乙醇，混合均勻。 (2) 在液氮條件下充分將組織研磨粉碎，將一定的樣品量（見 樣本使用量表）研磨成粉狀的組織加入到上述 300μl miRNA Reagent A 中，立即手腕用力震蕩至組織粉末溶解于裂 解液中。室溫靜置 5min 以充分裂解細胞。 注意：將組織加入到 miRNA Reagent A 后要迅速將組織震散，否 則易引起組織成團狀，不容易裂解。如發生成團狀，務移液器 將團狀組織吹打松散。 (3) 向上述裂解完畢的裂解液中加入 350μl miRNA Reagent B，上下顛倒混合均勻。13,000rpm 離心 5min，吸取 550μl 上清液，轉移到新的 1.5ml EP 管中。 (4) 向上述溶液中加入 200μl 無水乙醇，手腕用力震蕩數次， 室溫放置 5min。 (5) 13,000rpm 離心 10min，轉移 700μl 上清液到新的 1.5ml EP 管中。 (6) 向上述溶液中加入 300μl 異丙醇，手腕用力上下顛倒數 次。 (7) 分兩次將上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (8) 向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (9) 向吸附柱中加入 500μl 無水乙醇洗滌一次，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (10) 吸附柱 13,000rpm 空離心 2min，去掉殘留的乙醇。 (11) 將吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室溫放置 2min，使 殘留乙醇揮發。在吸附柱濾芯上加入 30μl RnaseFree TE Buffer，室溫靜置 2min，13,000rpm 離心 2min，洗脫產物 即為提取的 miRNA。（通常取 1～2μl 該產物，即可使用 一步法 miRNA 反轉錄試劑盒進行反轉錄反應，

2. 細胞樣本提取 (1) 貼壁細胞：消化細胞后，離心收集細胞沉淀。用 100μl 1×PBS 重懸細胞后，加入 300μl miRNA Reagent A 顛倒混 合均勻，室溫放置 5min。 (2) 懸浮細胞：直接離心后，收集細胞沉淀。用 100μl 1×PBS 重懸細胞后，加入 300μl miRNA Reagent A 顛倒混合均勻， 室溫放置 5min。 (3) 向上述裂解完畢的裂解液中加入 250μl miRNA Reagent B，上下顛倒混合均勻。13,000rpm 離心 5min，吸取 550μl 上清液，轉移到新的 1.5ml EP 管中。 注意：加入細胞體積數與 miRNA Reagent B 總體積數為 350μl。如加入 50μl細胞，則 miRNA Reagent B使用 300μl。 (4) 向上述 550μl 上清溶液中加入 200μl 無水乙醇，手腕用 力震蕩數次，室溫放置 5min。 (5) 13,000rpm 離心 10min，轉移 700μl 上清液到新的 1.5ml EP 管中。 (6) 向上述溶液中加入 300μl 異丙醇，手腕用力上下顛倒數 次。 (7) 分兩次將上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (8) 向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (9) 向吸附柱中加入 500μl 無水乙醇洗滌一次，13,000rpm 離心 1min，倒掉過濾液。 (10) 吸附柱 13,000rpm 空離心 2min，去掉殘留的乙醇。 (11) 將吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中，室溫放置 2min，使 殘留乙醇揮發。在吸附柱濾芯上加入 30μl RnaseFree TE Buffer，室溫靜置 2min，13,000rpm 離心 2min，洗脫產物 即為提取的 miRNA。（通常取 1～2μl 該產物，即可使用 一步法 miRNA 反轉錄試劑盒進行反轉錄反應，。

常見問題匯總： (1) 本方法提取的小 RNA，95％以上為小 RNA（200nt 的 RNA，通常殘留的>200nt RNA 不影響后續試驗操作。 (2) 本試劑盒提取的小 RNA 由于不含 mRNA 等大分子量的 RNA，因此更適合做后續反轉錄試驗，從而進行定量試驗。 (3) 使用本試劑盒提取的 miRNA 濃度通常在 50ng/μl 左右， 取 5～10μl 即可用于電泳檢測。取 1~2μl 即可用于 HG TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒進行反轉錄反應

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優化。