HG TaqMan miRNA定量PCR試劑盒

描述：HG TaqMan miRNA 定量PCR 試劑盒， 采用特異性的正向 miRNA 引物和接頭引物進行 PCR 擴 增，檢測熒光基團采用 FAM 標記的特異性 miRNA TaqMan 探針（原理見圖 1）。使用該試劑盒可以特異性、 高靈敏度的檢測低至 100 個細胞的 miRNA 分子。 的 TaqMan miRNA 定量 PCR 試劑盒共有一萬 余種，每一個 mircoRNA 分 子對應一個檢測試劑盒（包含特異性的 TaqMan 探針、正 向引物、反向引物、定量試劑），可在 HG TaqMan miRNA qPCR kit.xls 中查詢。如果您研究的 mircoRNA 分子不在 我們的列表中，請來信咨詢，我們將及時給您優化設計。 內參基因可選擇使用： （1）TaqMan RNU6B miRNA 定量 PCR 試劑盒適用于人、鼠等哺乳動物組織、細胞樣品； （2）TaqMan hsa-miR16 miRNA 定量 PCR 試劑盒適用于來源于人、鼠全血樣品。

組分：

儲存：避光置于-20°C，可保存 2 年；避免反復凍融
1 配制反應體系(20μl)
5×Golden HS TaqMan qPCR Mix 4 μl
20×miRNA TaqMan Assay 1 μl
*cDNA 模板 1～2.5 μl
ddH2O Up to 20 μl
2 進行 Real-Time PCR 反應
通常采用兩步法，程序如下：
 Stage 1: 95℃ 15 min（熱啟動，不可縮短時間）
 Stage 2: 95℃ 10 s
 60℃ 30 s 40cycles
（收集信號采用 FAM 染料通道，Rox 矯正信號選擇 None）
3 反應結束后確認 Real-Time PCR 的 cDNA 樣品和 NTC
陰性對照的擴增曲線。

一、模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成         等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；

六、酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT，對RNA樣品的質量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。
②隨機引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關系，一般建議每5µg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產物（＜500bp）的增加和長片段、全長產物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個基因序列的一部分，與模板互補的引物。該引物需要結合目標RNA的已知序列進行設計。由于引物和RNA序列特異性結合，每個目標RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當分析多種目標時，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對退火溫度進行優化。