蛋白熱穩(wěn)定性的高通量分析

      從現(xiàn)在開始，Applied Biosystems® 實時定量PCR系統(tǒng)又有了一個新用途，那就是分析蛋白的熱穩(wěn)定性，包括配體-蛋白結(jié)合的高通量篩選，促進蛋白穩(wěn)定性的緩沖液條件的優(yōu)化，以及突變或修飾對蛋白熱穩(wěn)定性的影響。這是因為，Life Technologies新推出了Protein Thermal Shift™（PTS）解決方案，它包括Protein Thermal Shift™ 試劑和軟件

      蛋白是關(guān)鍵的分子，在藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)過程中作為新藥靶點進行研究。藥物開發(fā)包括在多個不同分析中對數(shù)千個小分子和配體進行高通量篩選，這作為先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)項目的一部分，通常需要幾個月的時間。蛋白靶點也是一個挑戰(zhàn)，因為它們?nèi)菀捉到夂途奂?mdash;—需要加入無配體的蛋白穩(wěn)定性篩選。除了藥物開發(fā)，科研和工業(yè)中許多利用天然蛋白的其他研究項目也采用蛋白熱穩(wěn)定性篩選，這種篩選是利用蛋白熔解技術(shù)開展的。例如，在蛋白純化、結(jié)晶和功能鑒定中鑒定并使用能zui大程度穩(wěn)定蛋白的配體和/或溶液（緩沖液）條件。與現(xiàn)有技術(shù)相比，Protein thermal shift分析技術(shù)能夠提高蛋白純化和結(jié)晶的成功率，并降低藥物開發(fā)的成本，提供了一種快速、經(jīng)濟且高通量的篩選方法。在我們實時定量PCR系統(tǒng)上運行的Protein Thermal Shift™ 應(yīng)用讓您能廉價地：

• 篩選樣品的相對蛋白熱穩(wěn)定性
• 以高通量形式篩選配體與蛋白的結(jié)合

• 篩選能與您的蛋白靶點結(jié)合的小分子和片段文庫候選藥物
• 篩選能與您的蛋白靶點結(jié)合的抗體

• 在蛋白點突變后篩選樣品的穩(wěn)定性變化
• 系統(tǒng)鑒定適當/*的緩沖液條件，以測定蛋白與配體的相互作用• 鑒定*緩沖液條件，以改善蛋白的純化和分離
• 篩選緩沖液，以鑒定出成功的結(jié)晶條件生物通

• 篩選緩沖液，以鑒定出蛋白的*儲存條件
Protein Thermal Shift™ 技術(shù)如何起作用？蛋白穩(wěn)定性取決于蛋白的儲存或反應(yīng)緩沖液環(huán)境中的pH、鹽含量及各種輔助因子的存在。實時熔解實驗使用蛋白結(jié)合染料（如Protein Thermal Shift™ 染料），在Applied Biosystems® 任何實時定量PCR系統(tǒng)（包括StepOne™、StepOnePlus™、7500、7500 Fast和ViiA™ 7系統(tǒng)）上運行，產(chǎn)生目的蛋白在某一待測緩沖液環(huán)境中特異的熒光圖像。pH、鹽含量或待測緩沖液組分的變化反映為此熒光圖像以及由此計算出的Tm（熔解溫度）的相對變化。配體與蛋白的結(jié)合對蛋白的熱穩(wěn)定性也有著穩(wěn)定作用，從而導(dǎo)致蛋白的熒光圖像呈現(xiàn)出可測量的差異。
Protein Thermal Shift™ 分析Protein Thermal Shift™ 試劑實現(xiàn)了蛋白熔解分析，這作為一個的篩選工具，可測定蛋白熱穩(wěn)定性，鑒定適當?shù)木彌_液條件，并測定蛋白-配體的相互作用。這種Protein Thermal Shift™ 分析允許系統(tǒng)鑒定*的緩沖液條件以及能夠穩(wěn)定蛋白的配體。
Protein Thermal Shift™ 分析極易設(shè)置與運行，且整個流程一般需要0.5-2小時，這取決于所使用的系統(tǒng)和運行條件。我們實時定量PCR系統(tǒng)的可調(diào)節(jié)升降溫速率和熱準確性帶來了充分的靈活性，可實現(xiàn)較短的運行時間，并順應(yīng)篩選流程的需求。

Protein Thermal Shift™ 分析中的步驟
• 將蛋白、緩沖液、配體（如果適用）與Protein Thermal Shift™

• 在Applied Biosystems® 實時定量PCR儀上運行熔解曲線實驗
• Protein Thermal Shift™ 染料與暴露的疏水區(qū)域結(jié)合并發(fā)出熒光
• 根據(jù)熔解曲線計算出熔解溫度（Tm）
•Protein Thermal Shift™ 軟件
Protein Thermal Shift™ 軟件可直接根據(jù)Applied Biosystems® 實時定量PCR儀器生成的文件來分析蛋白熔解的熒光讀數(shù)。不同蛋白將有著不同的thermal shift圖像，每一個都有*的熔解曲線形狀、斜率、信噪比和溫度熔解范圍。Protein Thermal Shift™ 軟件根據(jù)以下兩種方法，從這些曲線中生成一個或多個熔解溫度（Tm值）：Boltzmann派生的Tm和衍生曲線確定的Tm。Boltzmann Tm值是取自熒光熔解曲線圖的拐點（圖1，上圖），而衍生的Tm值是取自衍生曲線峰的頂部（圖1，下圖）。Boltzmann方法將自動（或手動）鑒定的熔解區(qū)域內(nèi)的數(shù)據(jù)擬合成兩階段的Boltzmann模型，以生成Tm。一般來說，對于有著單個熔解區(qū)域的蛋白，可使用Boltzmann方法。然而，對于有著多個熔解區(qū)域的蛋白而言，可利用衍生方法來確定每個樣品的zui多六個Tm值。衍生方法利用原始數(shù)據(jù)的二階導(dǎo)數(shù)來預(yù)測溫度，其中衍生圖中可能存在zui多六個峰（局部極大值）。信噪比的經(jīng)驗衍生閾值可用來確定哪個局部極大值被檢測到。
蛋白研究人員使用多種方法來研究蛋白穩(wěn)定性及篩選配體，包括生物傳感器及其他高通量篩選（HTS）方法，以及較低通量的量熱儀和圓二色譜系統(tǒng)。這些方法能夠生成蛋白的大量細節(jié)，但要么太慢，需要大量蛋白樣品（量熱儀和圓二色譜），要么快但很貴（生物傳感器）。Protein Thermal Shift™ 技術(shù)以高通量形式滿足了快速廉價的樣品篩選需求，能夠迅速縮小候選物的數(shù)量，以便用其他技術(shù)進行更詳細的研究。Protein Thermal Shift™ 解決方案的靈活性、速度和易用性讓它成為那些需要了解蛋白穩(wěn)定性在整個研究階段如何受影響的蛋白研究人員的選擇。
圖1展示了蛋白結(jié)合配體的鑒定，如圖所示，與配體結(jié)合時，蛋白的Tm增加。紅色曲線代表了蛋白溶液的重復(fù)測定，而藍色曲線代表了同一蛋白在與配體共同孵育后的重復(fù)測定。對于此樣品，Tm從~41.5ºC變化至47.5ºC，表明蛋白穩(wěn)定性隨配體結(jié)合而增加。