染色質免疫沉淀（ChIP）實驗指南及技術總結
       

      ChIP是一項比較流行的研究轉錄因子（transcriptionfactor,TF）與啟動子（promoter）相互結合的實驗技術。由于ChIP采用甲醛固定活細胞或者組織的方法，所以能比較真實的反映細胞內TF與Promoter的結合情況。當用甲醛處理時，相互靠近的蛋白與蛋白，蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會產生共價鍵。細胞內，當TF與Promoter相互結合（生物意義上的結合）時，它們必然靠的比較近，或者契合在一起，這個時候用甲醛處理，能使它們之間產生共價鍵。
染色質免疫沉淀分析（ChiP）是基于體內分析發展起來的方法，它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質－DNA復合物，并通過超聲或酶處理將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段，然后通過抗原抗體的特異性識別反應沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。它能真實、完整地反映結合在DNA序列上的調控蛋白，是目前確定與特定蛋白結合的基因組區域或確定與特定基因組區域結合的蛋白質的一種很好的方法。CHIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系。而且，CHIP與其他方法的結合，擴大了其應用范圍：CHIP與基因芯片相結合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內足跡法相結合，用于尋找反式因子的體內結合位點；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達調控中的作用。
一般ChIP的流程是：甲醛處理細胞---收集細胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA，結合抗體-靶蛋白-DNA復合物，并沉淀---對沉淀下來的復合物進行清洗，除去一些非特異性結合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。
       在PCR分析這一塊，比較傳統的做法是半定量-PCR。但是現在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向于Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP（其實就是用ChIP的方法研究細胞內蛋白與RNA的相互結合，具體方法和ChIP差不多，只是實驗過程中要注意防止RNase，zui后分析的時候需要先將RNA逆轉錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基礎上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據公司的要求來準備樣品）。
*天：
（一）、細胞的甲醛交聯與超聲破碎。
1、取出1平皿細胞（10cm平皿），加入243 ul 37％甲醛，使得甲醛的終濃度為1％（培養基共有9ml）。
2、37攝氏度孵育10min。
3、終止交聯：加*至終濃度為0.125M。450 ul 2.5M*于平皿中。混勻后，在室溫下放置5min即可。
4、吸盡培養基，用冰冷的PBS清洗細胞2次。
5、細胞刮刀收集細胞于15ml離心管中（PBS依次為5ml，3ml和3ml）。預冷后2000rpm 5min收集細胞。
6、倒去上清。按照細胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細胞終濃度為每200ul含2×106個細胞。這樣每100ul溶液含1×106個細胞。再加入蛋白酶抑制劑復合物。假設MCF7長滿板為5×106個細胞。本次細胞長得約為80％。即為4×106個細胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800ul。
7、超聲破碎：VCX750，25％功率，4.5S沖擊，9S間隙。共14次。
（二）、除雜及抗體哺育。
8、超聲破碎結束后，10，000g 4oC離心10min。去除不溶物質。
留取300ul做實驗，其余保存于-80oC。
300ul中，100ul加抗體做為實驗組；100ul不加抗體做為對照組；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M），65oC處理3h解交聯，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。
9、在100ul的超聲破碎產物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC顛轉混勻1h。
10、1h后，在4oC靜置10min沉淀，700rpm離心1min。
11、取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul抗體，另一管中則不加抗體。4oC顛轉過夜。
（三）、檢驗超聲破碎的效果。
取100ul超聲破碎后產物，加入4ul5MNaCl，65oC處理2h解交聯。分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。
第二天：
（一）、免疫復合物的沉淀及清洗。
12、孵育過夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC顛轉2h。
13、4oC靜置10min后，700rpm離心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀復合物。清洗的步驟：加入溶液，在4oC顛轉10min，4oC靜置10min沉淀，700rpm離心1min，除去上清。
洗滌溶液：a.low salt wash buffer-one wash
b.highsalt wash buffer-one wash
c.LiCl wash buffer-one wash
d.TE buffer-two wash
15、清洗完畢后，開始洗脫。洗脫液的配方：100ul10％SDS，100ul1MNaHCO3，800ulddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脫buffer，室溫下顛轉15min，靜置離心后，收集上清。重復洗滌一次。zui終的洗脫液為每管500ul。
16、解交聯：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）。
混勻，65oC解交聯過夜。
第三天：
（一）、DNA樣品的回收
17、解交聯結束后，每管加入1ulRNaseA（MBI），37oC孵育1h。
18、每管加入10ul0.5MEDTA，20ul1MTris.HCl（PH6.5），2ul10mg/ml蛋白酶K。
45oC處理2h。
19、DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒。zui終的樣品溶于100ulddH2O。
（二）、PCR分析