摘要：作者開(kāi)發(fā)了一種方法來(lái)比較各種C-18液相色譜柱及C-8液相色譜柱，此方法是基于各種液相色譜柱對(duì)極性和非極性化合物的保留時(shí)間、對(duì)稱性及選擇性的差異。這個(gè)用于比較各種色譜柱的實(shí)驗(yàn)既反映了鍵合相的疏水性，又反映了硅烷基質(zhì)的活性。作者收集了色譜柱的保留時(shí)間數(shù)據(jù)并列成圖表，以供選擇替換柱和后備柱時(shí)使用。

    C-18和C-8硅烷液相色譜柱是液相色譜儀（HPLC）中zui常使用的色譜柱，而且，在美國(guó)市場(chǎng)上有多于100種C-18和C-8色譜柱出售。面對(duì)這么多可供選擇的色譜柱，分析工作者很難從中選出適當(dāng)?shù)纳V柱來(lái)具體使用，同時(shí)更難選擇出一根合適的替換柱。
    對(duì)于非極性樣品（如小分子芳烴）或弱極性樣品（如對(duì)羥基苯甲酸酯），C-18和C-8色譜柱是zui容易選擇的。對(duì)于這類樣品，色譜柱之間的主要差異在于保留因子（k）；而在選擇性方面卻只有微小的差異。但對(duì)于極性和中等極性樣品色譜柱的選擇卻相當(dāng)困難。例如含氨基或酸性基團(tuán)的藥物化合物。分析工作者會(huì)發(fā)現(xiàn)極性樣品在保留時(shí)間、選擇性和峰形都有很大的差別。
    色譜柱的選擇性和峰形受到擔(dān)體硅膠的影響遠(yuǎn)大于鍵合相的影響。另外，有研究報(bào)道在反相色譜中表面硅烷醇、硅酸及金屬雜質(zhì)的影響。在特殊情況下，選擇性的差異可由填料制備時(shí)使用的鍵合過(guò)程決定的。
    通常情況下，色譜工作者選擇HPLC色譜柱是通過(guò)比較由色譜柱供應(yīng)商所提供的填料介質(zhì)的規(guī)格來(lái)決定的。這些規(guī)格內(nèi)容包括：表面積、末端封尾、含碳量、顆粒形狀、顆粒尺寸、孔徑、孔容積、裝填密度和鍵合度。含碳量和鍵合度僅由色譜制造商提供，沒(méi)有這些規(guī)格使用者不可能計(jì)算出碳的克數(shù)，也不可能計(jì)算出一根色譜柱中鍵合相的微分子數(shù)。分析工作者可使用這兩個(gè)數(shù)據(jù)來(lái)估計(jì)一根色譜柱的疏水性質(zhì)。然而，即使制造商提供所有上述規(guī)格數(shù)據(jù)，使用者也不可能地預(yù)測(cè)出色譜柱對(duì)含有極性官能團(tuán)的化合物的選擇性。
    由于色譜的保留時(shí)間是基于分析物和填充基質(zhì)之間許多微妙的相互作用，我們建議使用混合物測(cè)試來(lái)比較填充基質(zhì)的規(guī)格與性能。Engelhardt和他的同伴回顧了硅烷反相色譜的特性，并且提出用溶解物試驗(yàn)來(lái)描述固定相的疏水性和親硅基醇特性。另外有一些人也改進(jìn)了測(cè)試條件和方法來(lái)解釋那些色譜數(shù)據(jù)，但他們只測(cè)試了很少的商品色譜柱，并且在他們的測(cè)試混合物中沒(méi)有羧酸。在本文中，我們使用了一個(gè)含有羧酸的測(cè)試混合物來(lái)收集了86根C-18和C-8硅烷色譜柱（見(jiàn)表1）的數(shù)據(jù)。我們將測(cè)試結(jié)果詳細(xì)描述如下。表1：研究中所使用的色譜柱的生產(chǎn)商（略）。
    在我們的比較中，我們使用了含有6種物質(zhì)的測(cè)試混合物，此6種物質(zhì)列于圖1。每一種物質(zhì)在測(cè)試混合物中都起特殊的作用。*是用于產(chǎn)生空體積。甲苯是測(cè)試色譜柱的疏水性。吡啶和N，N-二甲基苯胺是用來(lái)測(cè)試硅醇基對(duì)堿性物質(zhì)的活性的堿性胺類物質(zhì)。*是一種弱酸，用于與吡啶聯(lián)合起來(lái)確定活性擔(dān)體硅的數(shù)量。4-正丁基苯甲酸是一種用于測(cè)試硅醇基對(duì)酸性物質(zhì)的活性羧酸，此方面是色譜柱制造者開(kāi)發(fā)堿性去活色譜柱來(lái)作胺類物質(zhì)分析時(shí)經(jīng)常忽略的。
    我們使用的流動(dòng)相是含有65%的乙腈和35%的濃度為0.05M的磷酸鉀混合溶液，pH值為3.2。pH=3.2的緩沖溶液可使4-正丁基苯甲酸質(zhì)子化，同時(shí)可提高吡啶和N，N-二甲基苯胺的保留時(shí)間的重現(xiàn)性。我們發(fā)現(xiàn)使用沒(méi)有加緩沖溶液的流動(dòng)相，如65%乙腈和35%水，即使我們使用同一瓶流動(dòng)相，也無(wú)法得到重現(xiàn)性較好的保留時(shí)間和峰形。高離子強(qiáng)度的緩沖溶液，如本次測(cè)試所使用的0.05M的緩沖溶液，會(huì)抑制一些硅醇基的活性（2，5），但對(duì)于將胺從一些非堿性去活的反相色譜柱中洗脫下來(lái)，有一些抑制作用是必要的。
    我們測(cè)試過(guò)另外兩種緩沖溶液，但它們的作用均少于pH=3.2的0.05M磷酸鉀溶液。0.01M磷酸鉀緩沖溶液在pH=3.2時(shí)，胺類化合物在有些色譜柱中產(chǎn)生前移峰。0.05M磷酸鉀緩沖溶液在pH=7時(shí)，胺類物質(zhì)產(chǎn)生的峰形比在pH=3.2時(shí)更好。吡啶和N，N-二甲基苯胺的pKa均大約為5.2；因此，這些組分在pH=7時(shí)未質(zhì)子化并且呈中性，同時(shí)并不與強(qiáng)酸性的硅醇基發(fā)生離子交換作用。

實(shí)驗(yàn)部分
    配制0.05M的磷酸鉀緩沖溶液， 將6.8g的磷酸二氫鉀加入1LHPLC級(jí)的水中。加入濃磷酸直至pH=3.15-3.2（控制緩沖溶液的pH值在此范圍是非常重要的，因?yàn)檫拎ず蚇，N-二甲基苯胺對(duì)pH值非常敏感），用650ml乙腈和350ml緩沖溶液混合來(lái)配制流動(dòng)相，此混合物經(jīng)孔徑為0.45um的過(guò)濾器過(guò)濾。為了檢測(cè)流動(dòng)相配制是否正確，我們將測(cè)試混合物注射入一根色譜柱與此混合物在另一批正在使用的流動(dòng)相中的保留因子作比較。
    制備100ml測(cè)試混合物，先將65ml乙腈和4mg*，15mg吡啶，40mg*，15mgN，N-二甲基苯胺，30mg4-正丁烷苯甲酸及400mg甲苯混合，超聲波處理一會(huì)，然后加入35mlHPLC級(jí)的水，再超聲波處理直到所有固體溶解（將此測(cè)試混合物裝入2ml的瓶子，編號(hào)為1092，由AlltechAssociates 提供）。同時(shí)準(zhǔn)備各種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度與在測(cè)試混合物中的濃度相同。
    流速為1.0ml/min，注射器容量為10ul，柱溫為19-22℃，使用紫外吸收檢測(cè)器，波長(zhǎng)為254nm。關(guān)于色譜柱的直徑，除了Alltech 的alphaBond C-18和Waters的uBondapak C-18柱 （30cm×3.9mm）及Waters的Symmetry C-18和C-8柱 （15cm×3.9mm）之外，所有色譜柱均為15cm×4.6mm。
    關(guān)于填料顆粒直徑，除了Altech 的Adsorbosphere XL ODS（3um）；Waters 的Nova-Pak C-18（4um）；Synchrom 的Synchropak RPP C-18,300（6.5um）和Waters的uBondapak C-18、Alltech的Versapack C-18、Alltech的alphaBond C-18 以及Whatman 的Partisil OPS 和Partidil ODS-2（全是10um）以外，其余所有色譜柱均為5um。顆粒的尺寸僅作為介紹而列出來(lái)，如果制造者在制備各種尺寸的顆粒時(shí)使用相同的硅基和鍵合過(guò)程，則顆粒的尺寸不影響保留時(shí)間、選擇性或峰形。
    在比較中使用的色譜柱全是新的，不是剛填充填料的就是近來(lái)購(gòu)買的。用多于20倍柱容積的流動(dòng)相來(lái)沖洗所有色譜柱，并且重復(fù)地注射測(cè)試混合物直到各組分的保留時(shí)間變化少于0.02min。
    我們注射入標(biāo)樣來(lái)確定各組分的出峰順序并用所獲得的簡(jiǎn)潔的色譜圖來(lái)計(jì)算拖尾因子。我們沒(méi)有使用柱加熱器來(lái)控制柱溫，但我們確保了實(shí)驗(yàn)的環(huán)境溫度波動(dòng)少于3℃，環(huán)境溫度變化引起的保留因子變化少于3%，這樣溫度的變化在這次比較中可忽略不計(jì)。
    保留因子用k=（tr-t0）/t0來(lái)計(jì)算，式中tr是要檢測(cè)峰的保留時(shí)間，t0是*的死時(shí)間。計(jì)算拖尾因子（T）是使用美國(guó)藥典的公式T=W0.05/2f，式中W0.05是峰高5%處的峰寬，f是峰高5%處的峰的前沿邊緣到垂直的zui大半峰寬。