生物通報道：數(shù)字PCR無疑是PCR領域zui激動人心的創(chuàng)新之一，這一技術的誕生讓許多人定量的夢想成為現(xiàn)實。定量PCR和數(shù)字PCR都能實現(xiàn)對樣品中的核酸進行定量，它們之間的差別在于定量PCR依賴于標準曲線和參照基因，而數(shù)字PCR則能計數(shù)DNA分子進行定量。在許多領域的研究中數(shù)字PCR都是難以取代的寶貴技術，包括檢測罕見等位基因、在野生型背景下鑒定突變基因、區(qū)別低水平的拷貝數(shù)變異、驗證二代測序結(jié)果和基因表達分析等。數(shù)字PCR的基本工作原理很簡單，先將樣品劃分為多個PCR反應，每個反應zui多只含有一個目標分子，然后用熒光標記的探針進行檢測，計數(shù)含有目標分子的反應。正因如此，數(shù)字PCR不需要標準曲線，就可以真正實現(xiàn)對樣品的定量。不過，這并不意味著dPCR就永遠是的選擇。“盡管數(shù)字PCR能夠定量，其工作流程也比傳統(tǒng)qPCR簡單得多，但數(shù)字PCR的通量比較低，”Fluidigm公司的分子生物學主管Ramesh Ramakrishnan說。“總的來說，傳統(tǒng)qPCR通量更高，而數(shù)字PCR的靈敏度和性更好。在尋找罕見突變時數(shù)字PCR尤其適用。”
樣品分液（Partitioning）是決定數(shù)字PCR性的zui重要因素之一。數(shù)字PCR通過分液將樣品分成小份，通常每一份zui多只含有一個拷貝的目標核酸。熒光標記的探針可以用來揭示目標核酸存在與否，并由此獲得初始樣品中的分子數(shù)。“數(shù)字PCR這種方法非常簡單，一個陽性信號代表著一個目標分子，而沒有信號就意味著目標不存在，”Ramakrishnan說。Life Technologies公司的TaqMan® OpenArray® 數(shù)字PCR試劑盒可以在OpenArray® 平板上運行，OpenArray® 平板是一種不銹鋼的微流體平板，只有顯微鏡載玻片大小。這種平板的表面刻有3,072個通孔，每一個通孔都是一個獨立的PCR反應孔。每塊平板上的通孔排列形成48個子陣列，每個子陣列含64個通孔。OpenArray® 平板的外表面由疏水包被，而通孔內(nèi)部是親水包被，由此分隔各通孔中的樣品，使其無法彼此接觸和混合。
OpenArray® 平板可以在Life Technologies的OpenArray® 實時定量PCR系統(tǒng)和QuantStudio™ 12K Flex 上使用。QuantStudio™ 12K Flex dPCR儀能支持96孔或384孔板、TaqMan® Array卡片和中等密度的OpenArray平板。“QuantStudio™ 12K Flex dPCR儀能夠同時運行四個OpenArray平板，一次性生成12,228個單獨的PCR循環(huán)，并且實時收集PCR擴增的數(shù)據(jù)，”Life Technologies公司的qPCR資深產(chǎn)品Iain Russell說。“OpenArray數(shù)字PCR平板的開放性，使研究者們可以根據(jù)自身需要，對反應的重復數(shù)進行調(diào)整，在通量、性能和實驗成本之間達到平衡。你可以每種樣品只使用一個子陣列，這樣運行一次就可以得到192個數(shù)字PCR結(jié)論。或者你也可以一種樣品運行四個平板（192個子陣列），使系統(tǒng)性能和可重復性zui大化。”Fluidigm和Life Technologies采用微流體芯片和微流體通道進行數(shù)字PCR。與此不同的是，Bio-Rad選擇將樣品分為微小的液滴，RainDance Technologies隨后也加入了這一行列。“我們的*優(yōu)勢在于，可以將樣品分為1納升液滴，這些液滴的一致性和可重復性都非常好。通過這一技術，我們可以將每個樣品分為20,000個液滴，” Kurtz說。其他系統(tǒng)的分液數(shù)量大多在760到3,000之間，“分液數(shù)量越多可以使分析更為。”由于分液更多，在Bio-Rad的系統(tǒng)中每個液滴能容納多至五個目標，大大提高了檢測的動態(tài)范圍。“我們的系統(tǒng)可以解析1至100,000個目標拷貝，因此不需要在運行數(shù)字PCR之前對樣品進行系列稀釋，”Kurtz補充道。