国产精自产拍久久久久久蜜,亚洲视频在线观看,亚洲小说图片,国产伦精品一区二区三区免.费

實驗原理

1. DNA ） 片段回收方法：DNA ）片段在適當濃度的瓊脂糖凝膠中，通上一定電壓進行電泳，不同大小的DNA 分子由于遷移率的不同而分離開。切下帶有所需DNA） 片段的凝膠，用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化。
2. 利用Taq酶能夠在PCR產物的3’末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以把PCR產物插入到質粒載體的多克隆位點，可用于PCR產物的克隆和測序。

實驗試劑

1. pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）
2. TAE電泳緩沖液
3. 瓊脂糖（Agarose）
4. 6×電泳加樣緩沖液：0.25％溴粉藍，40％（w/v） 蔗糖水溶液，貯存于 4℃。
5. 溴化乙錠（EB）溶液母液：配制成10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲于室溫即可。
6. 70%乙醇
7. 膠回收試劑盒（Omega公司）

實驗設備

1. 水平式電泳裝置

2. 電泳儀

3. 臺式高速離心機

4. 恒溫水浴鍋

5. 微量移液槍

6. 微波爐或電爐

7. 紫外透射儀

8. 凝膠成像系統或其它照相設備

實驗步驟

1. 膠回收試劑盒回收PCR產物（以Omega公司 Gel Extraction Kit為例）

   1） 當目的片段DNA*分離時，轉移凝膠至紫外燈上盡可能快地切下目的片段。
   2） 凝膠塊轉移至1.5ml離心管（離心管已經稱重了）中，稱重得出凝膠塊的重量。近似地確定其體積（假設其密度為1g/ml）。加入等體積的Binding Buffer（XP2），于55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠*融化，每2-3 min振蕩混合物。（在凝膠*溶解之后，注意凝膠-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的話，DNA的產量將大大減少。如果是橙色或紅色，則要加入5μl 濃度為5 M，pH為5.2的醋酸鈉，以調低其pH值。該混合物的顏色將恢復為正常的淺黃色。）
   3） 取一個干凈的HiBind DNA Mini柱子裝在一個干凈的2ml收集管內（已備好）。
   4） 將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉移至柱子中。室溫下10,000 x g離心1分鐘。棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內收集管。
   5） 如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul，一次只能轉移700ul至柱子中，余下的可繼續重復第5步至所有的溶液都經過柱子。每一個Hibind DNA回收純化柱都有一個極限為25μg DNA的吸附能力。如果預期產量較大，則把樣品分別加到合適數目的柱子中。
   6） 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內收集管。轉移300μl Binding Buffer（XP2）至柱子中，室溫下， 10,000 x g下離心1min。
   7） 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內收集管。轉移700μl SPW Wash buffer（已用無水乙醇稀釋的）至柱子中。室溫下10,000xg離心1min。（濃縮的SPW Wash Buffer在使用之前必須按標簽的提示用乙醇稀釋。如果DNA洗滌緩沖液在使用之前是置于冰箱中的，須將其拿出置于室溫下）。
   8） 重復用700μl SPW Wash buffer洗滌柱子。室溫下10,000xg離心1min。
   9） 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內收集管。室溫下,13,000 x g離心2 min以甩干柱子基質殘余的液體。
   10） 把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入15~30μl（具體取決于預期的終產物濃度）的Elution Buffer（或TE緩沖液）到柱基質上，室溫放置1min, 13,000xg離心1min以洗脫DNA。*次洗脫可以洗出70-80%的結合DNA。如果再洗脫一次的話，可以把殘余的DNA洗脫出來，不過那樣的濃度就會較低。

2. 連接反應（以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit為例）

   1） 在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5 μl。
   pMDTM18-T Simple Vector 1 μl
   Insert DNA 0.1 pmol～0.3 pmol
   dH₂Oup to 5 μl
   2） 加入5 μl（等量）的 Solution I。
   3） 16℃反應30分鐘。（2 kbp以上長片段PCR產物進行DNA克隆時，連接反應時間請延長至數小時）。
   4） 全量（10 μl）加入至100 μl 感受態細胞中，冰中放置30分鐘。
   5） 42℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。
   6） 加入890 μl LB培養基，37℃振蕩培養60分鐘。
   7） 在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落。計數白色、藍色菌落。
   8） 挑選白色菌落，鑒定載體中插入片段的長度大小。

注意事項

1. 使用新鮮的電泳緩沖液TAE Buffer。不要重復使用，其PH的升高會減少產量。
2. 不論采取何種方法回收DNA，在回收過程中，要盡量減少洗脫體積，以便提高收得率和濃度，以方便后續操作。
3. 從膠上回收DNA時，應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈（300-360nm），以減少紫外光對DNA的切割。DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒。
4. 連接反應時間是與溫度密切相關，因為反應速度隨溫度的提高而加快。通常可采用16℃連接4小時為宜，如是平端連接需要適當延長反應時間以提高連接效率；在選擇反應的溫度與時間關系時，也要考慮在反應系統中其他因素的影響。
5. 連接反應的整個過程應注意槍頭的潔凈以避免造成對酶的污染，為防止酶活性降低，取酶時應在冰上操作且動作迅速。
6. 連接反應應在25℃以下進行，溫度升高較難形成環狀DNA，影響連接效率。長片段PCR產物（2kb以上）進行連接時，連接反應時間應延長至數小時。
7. 進行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾數比一般為1:2~10。根據實驗情況選擇合適的摩爾數比。
8. 用的感受態細胞（轉化效率≥1×10⁸ cfu/μg pUC19），這樣才可能得到比較理想的陽性克隆。