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人半乳糖凝集素3（Gal-3）免疫試劑盒使用說明

本試劑盒適用于以下樣本的測(cè)試（黑底字體為適用樣本）：

血清、血漿- 組織勻漿 –腹水 –細(xì)胞培養(yǎng)上清

本試劑盒僅供研究，不用于臨床診斷

目錄

1. 實(shí)驗(yàn)原理
2. 試劑盒組成
3. 試劑盒保存
4. 需要而未提供的試劑和器材
5. 試劑準(zhǔn)備
6. 樣本前處理
7. 洗板方法
8. 詳細(xì)操作程序
9. 操作總結(jié)
10. 性能參數(shù)

1. 實(shí)驗(yàn)原理：本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法法檢測(cè)樣本中半乳糖凝集素3（Gal-3） 的含量。向預(yù)先包被了抗體的酶標(biāo)孔中加入樣本，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的識(shí)別抗原，在37℃下孵育1小時(shí)，兩者與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形成免疫復(fù)合物，經(jīng)PBST洗滌后，結(jié)合的HRP催化TMB（四甲基聯(lián)苯胺）成藍(lán)色，隨后在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，在450nm波長(zhǎng)下有吸收峰，吸光值與樣本中抗原的濃度成負(fù)相關(guān)。

2.試劑盒組成：

備注：

• 試劑盒中“樣品稀釋液”為0.05M的PBS，“終止液”為2M的H2SO4，洗滌液為含0.15%吐溫-20的PBST，如不夠可自行配制。

b.不同公司的緩沖體系存在較大差異，請(qǐng)勿將本試劑盒的試劑與其他公司的試劑混用以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

c.濃縮洗滌液在低溫下會(huì)有少量鹽類析出，稍微加溫后即會(huì)消失，不影響使用。

3.試劑盒保存

本試劑盒可以在2-8℃下保存6個(gè)月，在-20℃下可以保存更長(zhǎng)的時(shí)間。酶標(biāo)板為真空包裝，板條可以拆卸，拆開以后如一次不能用完，請(qǐng)放入提供的密封袋中，放入干燥劑，2-8℃保存，在一個(gè)月之內(nèi)仍然有效。試劑不能反復(fù)凍融。

4．需要而未提供的試劑和器材

1. 37℃恒溫箱。
2. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
3. 精密移液器及一次性吸頭
4. 雙蒸水或超純水
5. 干凈的試管或Eppendof管
6. 吸水紙
7. 自動(dòng)洗板機(jī)或8道排槍
8. ELISA數(shù)據(jù)處理軟件，推薦使用ELISACalc
9. 500ml燒杯的和適當(dāng)量程的量筒

5試劑準(zhǔn)備

1. 使用前所有試劑應(yīng)置于室溫平衡至少30分鐘。
2. 本試劑盒可以直接加樣，如濃度過高，可以進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋（推薦2-5倍稀釋），計(jì)算時(shí)應(yīng)將結(jié)果乘以稀釋的倍數(shù)。
3. 洗滌液為25倍濃縮液，使用前將所有洗滌液倒入500ml或1L的燒杯中，用雙蒸水定容到500ml即為工作液。
4. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：取5支干凈的Eppendorf管，每管加150μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，分別標(biāo)記上1200pg/ml,600pg/ml, 300pg/ml,150pg/ml,75pg/ml.取150μl標(biāo)準(zhǔn)品原液加入標(biāo)記1200pg/ml的管中，混勻后同樣取出150μl，加入下一管，以此類推直至zui后一管。零孔：直接加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液。（見下圖）

    原液2400pg/ml   1200pg/ml  600pg/ml    300pg/ml   150pg/ml   75pg/ml

6樣本前處理

a.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
b.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
c.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
d.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
e.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
f.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

7洗板方法

1. 手工洗板：先洗去酶標(biāo)孔中的的液體，在吸水紙上拍干，然后每孔加入300μl稀釋好的洗滌液，輕輕搖晃30秒，然后甩掉，在吸水紙上拍干，重復(fù)4-5次。
2. 洗板機(jī)洗板：洗板機(jī)洗板比較便捷，但應(yīng)操作熟練后使用。

8詳細(xì)操作程序

1. 使用前請(qǐng)先將試劑盒在室溫下平衡半小時(shí)。
2. 空白孔不加樣，只加顯色劑A，B和終止液用于調(diào)零。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品孔：每孔加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50μl，零孔加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液50μl，然后加入酶標(biāo)試劑50μl。
4. 樣品孔：加入樣品50μl（推薦直接加樣，濃度高可以用樣品稀釋液稀釋2-5倍），然后加入酶標(biāo)試劑50μl。
5. 輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育60min。
6. 將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水25倍稀釋后備用。
7. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
8. 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。
9. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
10. 測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
11. 計(jì)算：根據(jù)濃度和OD值算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，建議用計(jì)算軟件進(jìn)行計(jì)算，推薦使用ELISAcalc進(jìn)行計(jì)算，擬合模型選用logistic曲線（四參數(shù)）。標(biāo)曲示意圖如下：

9操作總結(jié)

準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)60分鐘

洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10分鐘

加入終止液

10分鐘之內(nèi)讀OD值

計(jì)算

10性能參數(shù)

1. 批內(nèi)差：CV＜10%
2. 批間差：CV＜12%
3. 靈敏度：5pg/ml
4. 保存：    2-8℃
5. 規(guī)格：    96T/盒
6. 有效期：  6個(gè)月（2-8℃）。