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原代培養中成纖維細胞的抑制
點擊次數：8089 發布時間：2012-11-13
原代培養中成纖維細胞的抑制
成纖維型細胞：在培養中的細胞凡形態與成纖維細胞類似時，皆可稱之為成纖維細胞。本型細胞由形態與體內成纖維細胞的形態相似而得名，細胞在支持物表面呈梭形或不規則三角形生長，細胞*有卵園形核，胞質向外伸出2-3 厘米個長短不同的突起，除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間質起源的組織細胞常呈本類形態生長。
培養細胞的純化
【我是小米2】培養細胞的純化：
1、自然純化
即利用某一種類細胞的增殖優勢，而排擠其他細胞生長，靠自然的增值潛力zui后留下生長優勢細胞，去除其他細胞。有些惡性腫瘤細胞可以通過此方法，自然純化建立細胞系。
2、人工純化
（1）酶消化法
在消化培養細胞時，常是成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長的時間才脫壁，特別是在原代培養和培養早期這種差別尤為明顯，因而可以利用這種差異采用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開。
（2）機械劃除法
原代培養成功后，上皮細胞和成纖維細胞所數都同時出現，混雜生長。這種混雜生長常常分區成片，每種細胞都以小片或區域性分布的方式生長在瓶壁上。因此可以采用機械的方法去除不需要的細胞。
（3）反復貼壁法
成纖維細胞與上皮細胞相比，其貼壁過程快，大部分細胞常能在短時間內大約10－30min完成附著過程，而上皮細胞大部分在短時間內不能附著或附著不穩定，稍加振蕩即浮起，這樣可以利用此差別來純化細胞。
（4）克隆法
采用細胞克隆法將細胞分成單個細胞，使之分別生長成克隆，選擇出所需要的克隆。
（5）培養及限定方法
某些細胞在生長過程中必須存在或必須去除某種物質，否則無法生長，可以利用這種技術來純化細胞。
（6）流式分選
brdu
【sxtyzyq2】除了Brdu能用于抑制成纖維細胞的生長，便宜易買到的
【snany】阿糖孢苷效果不是特別理想
【cl1202】我在SD大鼠胃粘膜壁細胞原代培養的文獻中看到的：成纖維細胞大量生長是壁細胞分離培養失敗的常見原因。培養基中加入血清會刺激成纖維細胞而抑制壁細胞生長，對壁細胞可能還有一定的毒性作用。為了減少成纖維細胞的生長，先加入含有胎牛血清（100ml/L）的培養液，時差貼壁30-45分鐘，除去成纖維細胞，然后再換用無血清的培養液進行培養。不知道你有沒有用？試試吧。
【sxtyzyq2】買sigma公司的brdu然后把它配成終濃度為1 mmol/l然后1ml培養液中加入5微升就可抑制成纖維細胞
【gfeng8078】我是養心肌原代，也需要抑制成纖維細胞，請問各位大俠，5-brdu用多大的濃度？
【cheerfulness】養心肌原代 zui初24h培養液中加入終濃度為0.1mmol/L的brdu
【gfeng8078】你是怎么樣達到0.1mmol/L的濃度呀，由于有培養液的存在，加了Brdu進去，自然就稀釋了？我想把Brdu溶解于DMEM中然后一起抽濾，可是有報道說這對Brdu的藥效有影響
【jiangbin1230】請問用組織塊貼壁法能培養出腸的成纖維細胞嗎？我試過很多次了，一個皿就只有零散的一二十個成纖維細胞，都是柱狀上皮細胞，是否由于正常組織太少不能培養出啊？能幫幫忙嗎？
【sdf771214】請問成纖維細胞的帖壁時間一般是多少?我養的是內皮細胞,如何時差帖壁啊?
【victoh】不同來源的成纖維細胞在不同培養支撐介質上的貼壁時間應該是不一樣的，此外也還受到其他一些因素的影響，至于上皮細胞，其本身種類就更加復雜了
上皮細胞
【warmbull】我現在正在做的培養，但發現有幾瓶細胞可能是被成纖維細胞（長梭形、透明細胞）污染了，后來成纖維細胞抑制了色素上皮細胞的生長。現在又出現了這種情況，請問各位大俠，有什么辦法可以除去雜細胞？還有，我養的色素上皮細胞生長增殖很緩慢，有的甚至慢慢萎縮，會是什么原因呢？
【葉知秋】上皮細胞傳代次數多后，其形態就類似成纖維細胞，你也可以爬片作細胞鑒定，了解有無污染情況。生長緩慢除提高血清濃度外，還可以增加換液次數，及時分瓶傳代。
【yhdy2001】你可以試著用高糖培養基，這樣細胞增殖快，目前國外和國內較大的細胞研究所普遍采用高糖培養基；另外，做原代時取材很關鍵，盡量避免筋膜等組織的污染
【pigpig】曾經看過一篇論著，具體名字記不清了，里面從分子和蛋白水平論證了視網膜色素上皮細胞傳代4代以后基本沒有RPE原有性質特征，只具有成纖維細胞的特征。
【qkk1229】同意N代后就是成纖維細胞的模樣，很多細胞體外培養到后來，都長的象成纖維細胞，不知道為什么，有人知道嗎？
【jamesxia】去除成纖維細胞
1、反復貼壁法（差速貼壁法）：倒去舊培養液，用Hank′s液洗3次，然后加入消化液（0.2%EDTA+0.25%*），37℃10min，鏡下可見成纖維細胞成圓形，癌細胞維持原狀。吸出消化液，加Hank′s液吹打細胞使成纖維細胞脫落，吸出舊液，組織塊和癌細胞團用Hank′s液輕輕漂洗3次。加入培養液CO2孵箱，37℃，每周換液1次，處理1次。
2、血清濃度，上皮細胞耐受低血清環境的能力較強，而成纖維細胞的耐受力較差，利用這個差異，用含1.5%血清的培養液可以降低培養物中成纖維細胞的生長。
垂體細胞
【ccyy30】我在胚胎大鼠腺垂體細胞的原代培養中發現有好多的成纖維細胞和神經細胞，如何純化【luoyangu】原代培養中要除去較多的成纖維細胞，在接種細胞于膜插片前，按1～５*１０的５次方個／ml的細胞密度接種到大約5ml 單個細胞懸液到２５立方厘米培養瓶中，原代培養２天后，不經*消化，通過吹打收獲漂浮的細胞和被分散的細胞，離心（１５００轉／分，１０分鐘），再用培養液將細胞沉淀重新懸浮成細胞懸液，然后接種在膜插片上，這樣可以除去黏附的成纖維細胞而保留要的細胞．
【ccyy30】這種方法是否就是差速貼壁法，膜插片指的是多聚賴氨酸包被培養板嗎
星形膠質細胞
【gaowei98755】 我養過星形膠質細胞，我感覺想避免成纖維細胞的污染，需要注意兩方面：1，取材時一定要將腦膜、血管等結構*除去，寧可少留些腦組織，也要將雜質（權且這樣說，即其他結締組織）去除干凈。2，差速貼壁法，可以將細胞先差速貼壁20~30分鐘，將成纖維細胞去除，然后再將細胞懸液接種到其他瓶中，培養。這兩種方法可以聯合使用，也可以只用*種方法即可
心肌細胞
【gmwang1991】心肌細胞本來就是不容易貼壁的細胞，在除去心肌細胞中混雜的成纖維細胞和內皮細胞就是利用成纖維細胞和內皮細胞貼壁快而心肌細胞貼壁慢的原理進行換皿法來純化心肌細胞的。換皿后48小時內對你所培養的心肌細胞不進行任何處理，包括觀察，這樣應該沒有問題了。如果還是不能夠貼壁的話，你可以考慮一下用塑料瓶，或者對培養用的玻璃瓶進行如下處理：在培養前進行鼠尾膠原包被或者硝酸蝕刻或者纖粘連蛋白包被，在這方面有許多文獻報道的，你只需要注意看都會有解決辦法的。
【貓耳朵】乳鼠心肌細胞培養
盡量除去雜質細胞：現在一般的做法是：將消化*的細胞懸液先在大的培養瓶中培養1~2小時，然后再小心的吸出仍然懸浮的心肌細胞，再接種到6孔或24孔板上。這樣做主要是盡量除去成纖維細胞。由于成纖維細胞貼壁迅速，而心肌通常在4h后才開始貼壁，這樣才能盡量利用差速貼壁法除去成纖維細胞。
【windboy77】乳鼠心肌細胞屬于原代生長細胞，培養過程較為繁瑣。文獻上有多種濃度*消化方法，我們在試驗中摸索到0.06％濃度的*對細胞損害較小，比起一些文獻記載的0.15％濃度有一定的*性，但這個濃度消化所需時間較長，所以我們又采取多次反復低濃度消化的方法，每次消化一些后，用吸管抽取出上清液，離心所得即為心肌細胞。利用心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同, 采用差速貼壁1 h, 除去成纖維細胞，達到純化的目的。成纖維細胞胞體呈梭型或不規則三角形，*有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀。很好和心肌細胞鑒別。
胰島細胞
【genobody】大鼠胰島細胞原代培養
一周齡Wistar大鼠，斷頸處死，于75%乙醇浸泡15分鐘，無菌取出胰臟，于冰冷無菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔細清除脂肪、包膜、血管等胰外組織，轉入*小瓶中，加入少量無菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管輕輕吸出上層細小脂肪碎塊和油滴，再用無菌D-Hanks液反復清洗8~10次，加入10倍體積無菌消化酶液[*-膠原酶消化液：0.05g*（Sigma），0.025g Ⅴ型膠原酶（Sigma，663U/mg），0.05g葡萄糖，溶于100 mL無Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值為7.4）溶液，用0.22μm微孔濾膜濾菌]，38℃±1℃消化，消化過程中不斷震蕩，10分鐘后吸出上面酶液棄去，用無菌D-Hanks液將組織塊清洗2~3次，加入新鮮酶液繼續消化，重復上述步驟。此時組織塊邊緣模糊，再將組織塊浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分鐘，將消化酶液與組織塊分開，組織塊重新加入新鮮消化酶液進行消化；而原消化酶液1500rpm離心10分鐘，取沉淀即為消化下的細胞，重新用無菌D-Hanks懸浮，離心，重復1~2次，再用培養基洗2~3次，用培養基懸浮即得細胞懸液；將消化過的組織塊重復消化5~6次至組織塊消化*，重復以上操作，合并幾次所得細胞懸液，計數，調整細胞濃度為2×105個細胞/mL，將細胞懸液接種于24孔塑料培養板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養箱中培養。由于成纖維細胞貼壁要比胰島細胞迅速，接種15小時后，輕輕振蕩培養板，將上面未貼壁的細胞接入新的培養板中，可除去部分成纖維細胞。將新培養板中細胞培養48小時后，換新鮮配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培養基培養5小時，可除去絕大部分成纖維細胞，而胰島細胞不受傷害，換不含碘乙酸的培養基洗2次，并換不含碘乙酸的培養基在37℃，5%CO2，飽和濕度培養箱中培養，每隔3天換培養液，獲得單層胰島細胞，
【wangtsy】胰島的分離與純化
取新生1-3天SD大鼠10-15只，無菌條件下剖腹取出胰腺置入無菌培養皿中，用眼科剪去除非胰腺組織， 4℃ Hanks液清洗三次后，用眼科剪反復剪切至<0.5mm3組織塊，取濃度為1g/L的V型*5-10ml與之混合,轉入三角燒瓶中，于37℃恒溫水浴振蕩器消化30-40min， 加入兩倍體積4℃Hanks液終止消化，用吸管反復吹吸后過80目 篩網，濾液以800rpm低速離心70s去上清液，并用4℃ Hank's液低速離心清洗2次，除去單個腺泡及上皮細胞。加入含2.5mg/L碘乙酸的PRMI1640*培養基（含10%胎牛血清、10mmol/L HEPES緩沖液、1mmol/L丙酮酸鈉、100000u/L*G鉀、100mg/L*、71.5umol/L β-巰基乙醇）中制成細胞懸液,接種于75ml玻璃培養瓶中,于37℃,5%CO2,95%空氣條件下培養5h后，用無血清培養基低速離心清洗3次,以除去成纖維細胞。然后用正常*培養基培養24h，轉瓶棄去貼壁細胞，用無血清培養液低速離心洗滌兩次，沉淀物即為純化胰島。再用PRMI1640*培養基養吧，可長成胰島單層細胞。
內皮細胞
【benn】看到園子里有好多同仁培養大鼠主動脈內皮細胞,我也在做內皮細胞培養,現在看到一種新的大鼠主動脈內皮細胞的培養方法,正在摸索中,說出來與大家討論.
材料與方法：
材料 :
1.培養皿、培養瓶、燒瓶、試管，玻璃針等。
2.眼科剪、*、*片。
3.5%CO2孵箱、PH計。
4.恒溫水浴箱。
5.RPMi1640培養基，D-Hank’s緩沖液 、胎牛血清，內皮生長因子（ECGF），*，*,戊*鈉等。
方法：
1.取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠, 大劑量2%戊*鈉麻醉處死，將處死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超凈臺。在無菌狀態下剪開胸腹腔，分離胸主動脈,用2ｍｌ注射器從主動脈弓處向胸主動脈注入D-Hank’s液,驅除殘血,取主動脈弓至腎動脈一段，兩端結扎剪斷，放入60℃預熱無菌水中2秒。然后置于準備好的RPMi1640培養基（含雙抗）中。
2.剪切：在超凈臺上，將血管置于培養皿中,用*小心剝離外膜面的結締組織,并從根部剪去所有肋間動脈。無血清培養基沖洗數遍,去除殘血后,將動脈轉移至另一含少量培基的無菌培養皿中，用刀片將主動脈兩末端切去,剩下的主動脈切成寬1～1.5ｍｍ的環。
3.接種：將動脈環豎直放入35ｍｍ培養皿（1%明膠4℃預置過夜,用前2ｈ移入ＣＯ2培養箱,用前培養液沖洗）中。置ＣＯ2培養箱2ｈ后,加入1.5ｍl培養基。放入37℃,5%ＣＯ2培養箱中培養。72ｈ后細胞從環內外生長遷出,環內為內皮細胞,環外為成纖維細胞。將動脈環除去后,可看到內膜面細胞集落與外膜面之間有明顯的無細胞區界限，用玻璃針剔除成纖維細胞,得到純的內皮細胞生長克隆。繼續培養10～15ｄ，此時FBS濃度為２０％,形成細胞單層。
4.置于5%CO2孵箱中培養，每隔3天換液，培養時添加15% FBS，5～10μg/ml的內皮細胞生長因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。待細胞90%~95%融合時，0.25*消化傳代。
5.內皮細胞鑒定：相差顯微鏡下,細胞呈單層鋪路石狀;免疫組化證明有vWF相關抗原存在
6.注意事項:將分離出來的主動脈熱處理時溫度以60℃2秒為宜,太低則成纖維細胞多,太高或時間久則內皮細胞遷出減少.
【tomandmikes】如果原代培養后，臍靜脈內皮細胞和成纖維細胞并存，如何消除后者？盡管通過消化時間的調整可以避免成纖維細胞的存在，但是消化時間過短，收集的細胞數量較少，過長又會增加成纖維細胞污染的機會。
然而一旦污染之后，如何分離純化內皮細胞呢？有文獻報道，可以用消化法，根據消化時間的不同，來篩選內皮細胞，我一知半解，還請高手進來指教。
【Goodluck_XD】Simple, fast and efficient mouse endothelial cell isolation with Dynabeads. Isolated cells are pure and free of contaminating fibroblasts
Introduction
Endothelial cells line the entire vascular system, from the heart to the smallest capillary and control the passage of materials and the transit of leucocytes into and out of the bloodstream. Leucocytes interact with endothelial cells during trafficking, immune responses, inflammatory reactions and haemostasis. A pure population of cells, free from contaminating fibroblasts is required to study endothelial cells. Murine tissue is digested to obtain a single cell suspension. Dynabeads coated with an anti-murine endothelial cell antibody are added directly to the cell suspension and the bead-captured cells are separated with a magnet, Dynal MPC.
1.Endothelial cell isolation from murine tissues
A rapid, reproducible method for the isolation of murine tissue endothelial cells （EC） has been developed by Dong et al （1） using Dynabeads M-450 Sheep anti-Rat IgG coupled with a monoclonal rat anti-mouse CD31 antibody. After releasing the beads with trypsin/EDTA, the released cells were centrifuged and resuspended in growth medium for cell culture and further cloning.
Of 300 cells plated, 29 clones were obtained after two weeks and all clones were positive for CD31. To evaluate the specificity and recovery efficiency of this method, the CD31+ murine endothelial cell line H5V was mixed with a melanoma cell line and/or mixed with L929 fibroblasts. In both cases the percentage of isolated cells was > 98% and the recovery was 65% of the original CD31+ murine endothelial cells.
2.Primary mouse lung endothelial cell isolation from cultures
Hartwell et al （2） used lung tissue as plated cells. Dynabeads M-450 Sheep anti-Rat IgG were coated with rat anti-mouse intercellular adhesion molecule-2 IgG and added to the plated cells. After incubation, the cells were trypsinized to release all cells before isolation with the Dynabeads. Endothelial cells were stained for P-selectin, an adhesion receptor for leucocytes.
3.Pure fibroblast and endothelial cell colony cultures from murine bone marrow
The adherent stromal cells of bone marrow consist of endothelial cells, fibroblasts and macrophages. Endothelial cells and macrophages are phagocytic but fibroblasts are not. These differences can be used to isolate the different cell populations. Fei et al （3） used magnetic separation to obtain cultures of EC and fibroblasts （3）. Bone marrow cells were cultured and non-adherent cells poured off. The adherent cells were subsequently used in two ways:
i） To obtain endothelial cells, adherent cells were released from the culture plates with trypsin and Dynabeads M-450 Epoxy were added at the ratio 3 beads to 1 cell and incubated for 2 hours at 37°C. At this temperature, phagocytic cells in culture engulf the beads. The bead-captured cells were collected with the magnet and non-phagocytic fibroblasts discarded. The bead/cell complexes were then cultured in low concentration for 10 days to reduce macrophage growth. Endothelial cell clones （> 20 cells） were then picked and cultured again to confluent growth.
ii） To achieve pure fibroblasts more magnetic beads were used. A 40 bead to 1 cell ratio was added to trypsinized adherent cells to ensure all phagocytic cells （endothelial cells and macrophages） engulf beads. The bead-captured cells were collected and the non-phagocytic fibroblasts were collected and cultured. The fibroblasts were re-passaged to ensure there were no contaminating cells and then grown to confluence.
1.Q. G. Dong, et al., A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues -Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 1997; 17:1599-1604.
2.D. W. Hartwell, et al., Role of P-selectin cytoplasmic domain in granular targeting in vivo and in early inflammatory responses. Journal of Cell Biology 1998; 143 4:1129-1141.
3.R-G. Fei, et al., A method to establish pure fibroblast and endothelial cell colony cultures from murine bone marrow. Exp.Hematol. 1990, 18:953-957.
【zhaoqingshan】Goodluck_XD 斑竹的解決方案可能比較費銀子。
我也曾遇到過類似的問題，一般來說，原代的時候一定要盡可能的純，寧可錯殺一千，不可放過一個成纖維細胞，否則傳代后細胞就會比較雜。所以原代不夠純就放棄。另外，給足生長因子讓內皮充分的生長起來。
以前一個老師提供過采用膠原酶的方法，差速消化，不知道是否有效，樓主可以試試，有結果告訴我。另外，有些差速貼壁的方法，好像并不合適，因為內皮貼壁也很快的。
我也是聽說的，并不可靠啊，您試驗一下，就是用0.1%I型或II型膠原酶消化，試試，據說成纖維細胞會先掉下來。要是有結果，一定要告訴我啊！呵呵！
說實話，我養過好幾種內皮，就是沒有正兒八經的養過HUVEC，幫別人養過幾次，純度還可以（其實消化得好的話，不存在雜細胞的問題的，傳2-3代進行實驗沒有問題的），就是傳不了幾代。
【tomandmikes】是啊，純度的問題好說，可以摸索控制時間，但是要不加生長因子等刺激物，僅用培養基和血清，很難多次傳代。其實消化后的成纖維細胞不是很多，但見了很煩，我且試試你說的方法。不知道用*可以不可以？
【zhaoqingshan】應該是不可以的，我試過，換低濃度的*也不可以的。內皮和成纖維被消化下來的時間差不多。用ECGF 20ug/ml也不是很貴的，我倒覺得胎牛太貴了。因為我以前養腦微血管內皮用ECGF 150ug/ml。
混合星形細胞
【midas】混合星形細胞的培養
1、取材:取新生4天SD大鼠，頸動脈放血，無菌操作取出 腦組織，切除腦干和海馬，解剖顯微鏡下仔細剔除腦膜和血管等結 締組織。
2、機械分散:取大腦皮質轉移至試管中，并將其快速剪成 1 mm3 左右小塊，加適量培養液，用吸管輕輕吹打，使細胞分散，制成細 胞懸液，再經74 um網篩過濾，取濾液，離心，1500r/min, Smin, 重懸細胞，進行細胞計數。
3、細胞計數:臺盼藍:細胞懸液=1: 9染色，在顯微鏡下計 數。
4、接種與培養:調整細胞密度，以1 X 105/cm`的密度接種于 預先涂有多聚賴氨酸（poly-L-lysine, PLL）的培養瓶中，于培養 箱中孵育30min,翻轉瓶并吸出細胞懸液再接種于培養瓶中，以除去成纖維細胞。370C, 5% C0.2培養，每3天換液一次，培養10天。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態細胞，見細胞分為兩層:下層是 TIA，上層是0-2A祖細胞。
人胚嗅鞘細胞
【lvranbo1010】 人胚嗅鞘細胞的原代培養
將胚胎頭部剪下，浸泡在75％的酒精內3分鐘，大量D-Hanks*沖洗。*下，超凈臺內，迅速完整取出兩側嗅球,置于4℃的D-Hanks*中，小心除去軟腦膜,血管及與其相連的組織。然后用顯微器械剪取嗅球zui外兩層（嗅神經層和小球層,ONGL）,再用D-Hanks*洗3遍。置于含3－4ml DMEM/F12培養基的35mm2培養皿內，將剪取的ONGL組織塊用顯微器械小心撕開，再用火焰拋光后的移液管小心反復吹打至盡可能小（勿使培養基產生過多的氣泡），放入CO2培養箱（5%CO2,37℃）中培養。
人胚嗅鞘細胞的純化
取材于人胚嗅球的嗅鞘細胞在培養過程中有多種其他細胞，如來自血管、軟腦膜等結締組織的成纖維細胞,以及神經元、星狀膠質細胞、小膠質細胞等。其中，成纖維細胞是嗅鞘細胞培養體系中zui棘手的污染細胞,其分裂增殖和貼壁速度極快,遠遠超出嗅鞘細胞的分裂增殖和貼壁速度,且侵蝕面積大。這個特點與動物相似。用于動物嗅鞘細胞純化的方法很多，有差速貼壁、化學藥物法、梯度離心法、免疫親和吸附法等。目前國內外大多采用阿糖胞苷來達到純化的目的。但我們參考動物嗅鞘細胞的純化方法，在不同時間加入1×10－6－1×10－9濃度的阿糖胞苷，每數量級分別培養10次。我們發現，與動物嗅鞘細胞培養過程中阿糖胞苷純化效果較好相比，人胚的嗅鞘細胞用阿糖胞苷純化效果極不理想，且嗅鞘細胞數目大大減少。故試驗中，我們放棄了阿糖胞苷純化的方法，而采用了差速貼壁＋免疫親和吸附的純化方法。根據胎齡的不同，把含有嗅鞘細胞的培養基在CO2培養箱（5%CO2,37℃）中培養12－24小時。培養過程中，每2小時相差顯微鏡下觀察一次。如觀察到較多的立體感較強的細胞開始貼壁時，立刻將含有未貼壁的細胞的培養基接種到預先用Ｐ75抗體包被的35mm2培養皿內，放入CO2培養箱（5%CO2,37℃）中繼續培養。培養36－48小時換液, 祛除未能和Ｐ75 抗體結合的細胞。
人胚嗅鞘細胞的免疫細胞化學染色及免疫熒光染色及嗅鞘細胞純度檢測
用于嗅鞘細胞免疫染色的抗體較多[1]，有膠質纖維酸性蛋白（GFAP），p75 NTR等，因本培養皿預先用p75抗體包被，故選用GFAP（1：1500）抗體進行免疫染色。成纖維細胞不能為GFAP抗體所標記，而嗅鞘細胞對GFAP標記較敏感且染色均一。所以GFAP免疫組化法可用于鑒別嗅鞘細胞和成纖維細胞。GFAP免疫組化法的缺點是不能區別OECs與其他中樞神經膠質細胞如小膠質細胞等,但前者從形態上（嗅鞘細胞的細胞有一個甚至多個突起，且突起十分細長）很容易與這些細胞區別出來。將培養好的嗅鞘細胞繼續培養13d,分別在培養1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d棄掉上清,用0 .01MPBS清洗3次,接著用4%多聚甲醛固定30分鐘,再用PBS清洗3次,0.3％雙氧水處理10min,0.01MPBS清洗3次， Triton x-100洗30分鐘，0.01MPBS清洗3次。滴加正常山羊的血清封閉液封閉20分鐘后，甩去多余液體，不洗，加膠質纖維酸性蛋白（GFAP）羊抗血清,按ABC法進行免疫細胞化染色,同時進行免疫熒光染色，并設立空白對照和替代對照。將染色的細胞分別置于OLYMPUS倒置相差顯微鏡和OLYMPUS熒光顯微鏡觀察, 計數嗅鞘細胞的百分率。
免疫組織化學反應顯示：帶細長突起的單極、雙極或多極的梭形細胞抗－GFAP，抗－nestin均陽性，可以確定這些細胞為嗅鞘細胞。成纖維細胞為GFAP反應陰性,神經元也呈GFAP陰性反應。雖然星狀膠質細胞也為GFAP反應陽性,但從形態上容易區分兩種膠質細胞（見圖E－F）。
在治療中樞神經系統損傷，需要大量的純度較高的嗅鞘細胞，這是移植是否成功的基礎。我們認為，由于成纖維細胞的生長速度大大快于嗅鞘細胞，所以，通過差速貼壁的方法，可以祛除大部分的成纖維細胞，而免疫吸附可以使絕大部分的嗅鞘細胞貼壁，免疫吸附后培養36－48小時換液,能祛除未能和Ｐ75結合的其他細胞。如：神經元、星狀膠質細胞、小膠質細胞。此時獲得的嗅鞘細胞是純度比較高的。雖然近期文獻報道[2]，一定數量的其它細胞，可促進嗅鞘細胞的作用。但這尚需進一步的研究。
在動物嗅鞘細胞培養的實驗中，國內及大部分國外實驗室都通過加入阿糖胞苷來達到祛除成纖維細胞的目的。但我們實驗室通過分析不同時間點加入1×10－6－1×10－9濃度的阿糖胞苷培養結果，我們認為加入阿糖胞苷雖然可在短期內有效抑制成纖維細胞生長，但同時也抑制了嗅鞘細胞的生長，且在撤除阿糖胞苷很長時間后，嗅鞘細胞仍不能明顯增殖。同時有可能殘存的成纖維細胞由于失去了嗅鞘細胞高密度抑制從而迅速增生，使嗅鞘細胞純度迅速下降。
p75是神經營養因子低親和力受體,在嗅鞘細胞膜表面由跨膜、細胞外和胞質等三部分組成,其抗體能和細胞外部分發生特異性結合。因此,包被在培養皿上的p75抗體可以通過抗原抗體反應,在較短時間內將表達p75的嗅鞘細胞吸附在培養皿表面。而其它污染細胞由于缺乏p75，所以貼壁較慢。
人胚的嗅鞘細胞接種后，胎齡越小，貼壁所需時間越短。在有無血清的培養基中培養時，形態無明顯差異。人胚的嗅鞘細胞較動物嗅鞘細胞生長快，且體積與突起長度均較動物的嗅鞘細胞大。因此，我們可以認為不同種屬的嗅鞘細胞是有差異的。雖然表達有同樣的物質，但也可能表達不同的物質。所有這些需要進一步研究。這對于zui終的臨床應用有著重大意義。
間充質干細胞
【flyingpumc】兔骨髓間充質干細胞的培養方法
兔骨髓間充質干細胞的提取、分離:取日本大耳兔10 只,4 個月齡,體重215～310kg。用2 %*于手術部位施以局部麻醉,在無菌操作下以骨髓穿刺針刺入兔髂骨骨髓腔,接5ml注射器,內含3000U/ ml 的肝素0.2ml ,抽出骨髓4～6ml ,經低糖的DMEM 稀釋后,與Percoll 液（ Pharmacia ,比重1.073g/ ml） 按1∶1 的比例進行梯度離心,928g 離心20min。離心后緩慢吸取中間交界面乳白色云霧狀懸浮細胞至另一試管,以低糖的DMEM 洗滌兩次,懸浮。
將上述分離所得單核骨髓細胞按2.0 ×105/ cm2接種于含有10 %胎牛血清（FBS） 的HG2DMEM（含有*100μg/ ml 、*100μg/ ml ,pH7.2） 的聚苯乙烯一次性培養瓶內,于37 ℃,5 %CO2 ,100 %飽和濕度條件下進行細胞箱培養。于72h 后除去非貼壁細胞,同時更換新鮮的培養液,以后每隔1 天更換新鮮的培養液,用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態及其生長變化并攝像,待細胞生長鋪滿至瓶底約90 %以上融合時,用0.25 %*和0.01 %EDTA 消化貼壁細胞,取原代MSCs 進行相關的檢測,同時按同樣的密度進行傳代。
兔骨髓間充質干細胞的傳達培養:將傳代的第P1 代、第P4 代、第P8 代間充質干細胞,按每孔2 ×105個定量接種于24 孔培養板,次日起,每天取3 孔的細胞,經0.25 %*消化后,作細胞計數,直至基本鋪滿整個瓶底。按3 孔細胞均數取點,繪制其生長曲線。傳代培養過程中,隔日換液。
實驗研究用Percoll （密度為1.073g/ ml） 梯度離心法加貼壁培養方法提取MSCs 既是簡便的,又是實用的,與Ficoll （密度為1.077g/ ml） 梯度離心法相比,其比重較輕,能夠在梯度離心時利用MSCs 與成纖維細胞比重不同,將MSCs 與成纖維細胞分離開;單層貼壁培養法又將不能貼壁的造血細胞分離開。
肝細胞
【yangqingdoctor】從胎鼠肝中獲得的細胞培養后發現成纖維細胞特別多，而肝細胞較少，請問有什么辦法可以很好的去除成纖維細胞，percoll離心可以嗎，具體怎樣？
細胞傳代時，用*消化,細胞變化不大,還是貼壁,請問為什么,怎樣處理?
【huangxianzi】
1、試試看肝細胞培養基，如Gibco的Hepato－ZYME,可有效去除雜細胞。
2、還可試試梯度貼壁法，因成纖維細胞貼壁比肝細胞快，因此培養1小時后，換瓶，再重復一次，看看有無效果，但操作過程中，注意溫柔一些，因肝細胞在體外很難培養。
liubo4210482sin培養平滑肌細胞中,出現了很多的成纖維細胞,請問有什么好的辦法可以分離出它們???
有人說.用*消化以后,兩種細胞貼壁有快慢:成纖維細胞貼壁快,平滑肌細胞貼壁慢,靠掌握時間將它們分離開.
上面的說法是否正確,那么消化后,（細胞貼壁過程中）該在多少小時以后將懸浮液轉移,另外培養,才能得到比較純的平滑肌細胞???
shawm
多準備幾個培養皿，消化重懸后，你隨時觀察細胞，過一段時間取上清，轉入另一個培養皿。可以反復多次轉皿。你的平滑肌細胞在上清中，所以可以時間稍長一點，但別等到大部分細胞貼壁。
chaoyuan
1、差速貼壁法。成纖維細胞貼壁快,平滑肌細胞貼壁慢。
2、加入5-溴-2′-脫氧尿苷（5-Brdu）,終濃度為0.1 mM ，抑制成纖維細胞生長。