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大鼠嗅球成鞘細胞分離培養方法
點擊次數：286 發布時間：2012-10-25
大鼠嗅球成鞘細胞分離培養方法
1. 材料與方法
1.1 實驗動物及試劑
出生7-9d大鼠幼仔、手術器械、DMEM培養基和胎牛血清FBS、0.125%*、PBS等包被：Poly-L-Lysine多聚賴氨酸，儲存液濃度為4mg/ml，超純水稀釋（1:300）。使用時濃度為13.3ug/ml。24孔板每孔加50ul室溫孵育1h后吸去，超純水清洗后吹干。
DMEM培養基10ml，添加劑：*（146.15）2mmol/L0.3mg/ml ，牛胰島素 10ug/ml ，人轉鐵蛋白 100ug/ml， 硒（172.94） 0.224umol/L，0.04ug/ml 3,3',5-L-三碘甲狀腺原氨酸（672.96） 0.49umol/L，0.33ug/ml
1.2 實驗方法
1.2.1 脫頸處死大鼠幼仔，固定在手術板上，用75%乙醇噴灑頭部皮膚消毒
1.2.2 剪去頭部皮膚，然后作環形切口，除去顱蓋，在鼻尖處顯露腦和兩個嗅球
1.2.3 從腦部輕輕取下嗅球，用PBS清洗2~3遍，除去血塊和毛細血管等
1.2.4 剪碎組織塊,用濃度為0. 125 %的*37 ℃水浴消化15-20 min
1.2.5終止消化后輕輕吹打嗅球組織，過濾后離心（1000 r/ min ,5 min） 去除上清液,重復1-2次
1.2.6 重懸細胞沉淀，接種到多聚賴氨酸包被過的24孔板種，一只幼仔可接1~2孔，每天換液并觀察培養結果
2. 實驗結果
接種后觀察，細胞密度較高，同時血細胞較多；1 h后細胞開始貼壁，呈球形，難以辨認細胞的形態結構。24h后細胞大多貼壁，未出現形態。兩至三天后細胞形態穩定，生長較好，成纖維細胞較少。
3.討論
接種12 h 后有少量細胞貼壁, 懸浮細胞多見；24 h 后可見貼壁細胞增多，少數細胞變形, 呈長梭形；2 d 后變形細胞多見, 突起延伸變長；另可見極少數胞體大而圓、突起較多但較短的細胞， 確定為神經元。
1周后,細胞形態穩定，主要分為兩種：單極或雙極細胞 ，胞體類似圓形，突起細長，排列不規則，突起互相交織成網狀，這種細胞數量zui多；還有一種“煎蛋樣”細胞，胞核大，胞質散鋪圍繞在胞核周圍， 邊界不規則， 突起不明顯，形狀很似荷包蛋,故稱“煎蛋樣”細胞。這種細胞也較常見。這兩種細胞常獨立成片，少見交叉生長。
神經元胞體大，數量少，容易辨認。另外，還可見扁平長梭形細胞緊密貼壁，片狀生長，分裂迅速，此為成纖維細胞，這種細胞在*剝離外膜的狀況下并不多見。還有一種多突起呈星狀的細胞, 為星形膠質細胞, 此類細胞數量極少, 單個出現, 容易辨認。
嗅鞘細胞的純度隨培養時間的延長有所下降, 其zui主要的原因是雜細胞的生長及雜質的增多, 主要是成纖維細胞的生長，還有一些膠質細胞。隨著培養時間的延長, 殘留的部分成纖維細胞迅速增殖，造成污染。且雜質增多，使視野不清，純度下降。
不同的培養板OECs的形態有所不同，在未經多聚右旋賴氨酸處理的培養皿或培養瓶內培養的嗅鞘細胞，不但細胞增殖能力差，細胞形態與經賴氨酸處理過的培養板培養的細胞形態也有很大差別，細胞突起不能*伸展，變的粗短，沒有明顯的細長突起編織成的網狀結構。
研究表明，經多聚右旋賴氨酸包被的培養板比多聚左旋賴氨酸處理的培養板更利于嗅鞘細胞的生長。