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免疫血清制備方法
點擊次數(shù)：234 發(fā)布時間：2012-10-24
免疫血清制備方法
免疫血清的制備是一項常用的免疫學(xué)實驗技術(shù)。價、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑（如用于制備免疫標(biāo)記抗體等），也可供特異性*用。免疫血清的效價高低取決于實驗動物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強的抗原刺激高應(yīng)答性的機體，常可獲得價的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時，則需同時加用佐劑以增強抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時間間隔等，也是影響免疫血清效價的重要因素應(yīng)予重視。
一、原理
具有免疫原性的抗原可刺激機體相應(yīng)B細(xì)胞增殖、分化形成漿細(xì)胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細(xì)胞克隆所識別，因此由某一抗原刺激機體后產(chǎn)生的抗體，實際上為針對該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物（即多克隆抗體）。另外，抗體的產(chǎn)生具有回憶應(yīng)答的規(guī)律性，表現(xiàn)為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應(yīng)答特點截然不同。這是由于記憶性B細(xì)胞參與再次應(yīng)答所致。
二、免疫方法
根據(jù)抗原的性質(zhì)不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明。
1.用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚；
2.*次免疫：用2ml注射器吸取弗氏*佐劑（FCA）乳化的抗原（人IgG）下稱FCA-IgG）液1ml，每側(cè)腳掌皮下各注入0.5ml。
3.第二次免疫：間隔10-14天后，于兩側(cè)窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG，每個淋巴結(jié)注0.1ml，其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時，直接注入兩側(cè)窩及鼠蹊部皮下。
4.間隔7-10天后，從耳靜脈采血0.5~1.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價（即試血）。效價至少應(yīng)達(dá)到1∶16以上時才能放血。
5.若效價未達(dá)到要求，可用不加佐劑的抗原液（人IgG）耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次，分別為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價達(dá)到要求應(yīng)立即放血。另外，也可在第2次免疫后，以弗氏不*佐劑（FIA）乳化的抗原（人IgG）（簡稱FIA-IgG）再免疫1-2次。注射部位、劑量和間隔均同第2次，再試血測抗體效價，如效價達(dá)到要求立即放血。
三、放血
（一） 心臟采用血法
1.家兔仰面，四肢縛于動物固定架上（或由助手抓住四肢固定）；
2.剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；
3.用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動zui強的部位；
4.用50ml注射器（連接16號針頭），傾針45°角度，對準(zhǔn)心搏zui強處刺入心臟抽血致死；
5.將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。
（二） 頸動脈放血法
1.家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚；
2.沿頸部中線切開皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突肌；
3.分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動脈后使之游離；
4.于動脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動脈用*夾住；
5.用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；
6.松開*，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80~100ml。
四、分離血清
將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時，再置4℃冰箱內(nèi)3~4小時。待血液凝固血塊收縮后，用毛細(xì)滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑（0.01%硫柳汞或0.02%疊氮鈉，zui終濃度），分裝后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br />