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大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、重組DNA的轉(zhuǎn)化、克隆篩選

1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?br />通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞的技術(shù)以及篩選轉(zhuǎn)化體的技術(shù)。了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。
2. 相關(guān)知識(shí)及原理
感受態(tài)細(xì)胞（Competent cells）：
受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞（competent cell） 。
轉(zhuǎn)化（transformation）：
是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制－修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。
轉(zhuǎn)化的方法：
化學(xué)的方法（熱擊法）：使用化學(xué)試劑（如CaCl2）制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞；
電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。
克隆的篩選：
主要用不同抗生素基因篩選。常用的抗生素有：氨芐*、*、*、四環(huán)素、*等；將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。否則，如果將轉(zhuǎn)化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上，會(huì)出現(xiàn)成千上萬的細(xì)菌菌落，將難以確認(rèn)哪一個(gè)克隆含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。雖然只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)菌才能在含有抗生素的平板上生長和繁殖，但對(duì)于連接混合物而言，此時(shí)并不能確定哪個(gè)克隆含有插入片段。
重組質(zhì)粒克隆的鑒定
鑒定帶有重組質(zhì)?？寺〉姆椒ǔＳ玫挠衋- 互補(bǔ)、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法。zui常用的方法是小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析，對(duì)于帶有LacZ基因的載體還可以結(jié)合a-互補(bǔ)現(xiàn)象來篩選。
a-互補(bǔ)現(xiàn)象：
因?yàn)樵S多載體都帶有一個(gè)LacZ基因的調(diào)控序列和頭146個(gè)氨基酸的編碼信息，編碼a-互補(bǔ)肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型a-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)（a-互補(bǔ)）。當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞中時(shí)，在異丙基β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)下，宿主可同時(shí)合成這兩種肽段，雖然它們各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。所以稱這種現(xiàn)象為a-互補(bǔ)現(xiàn)象。
由互補(bǔ)產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶（LacZ）能夠作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－b －D－半乳糖苷（X-gal）而產(chǎn)生藍(lán)色的菌落，所以利用這個(gè)特點(diǎn)，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個(gè)多克隆位點(diǎn)，當(dāng)插入一個(gè)外源DNA 片段時(shí)，會(huì)造成LacZ（a-）基因的失活，破壞a-互補(bǔ)作用，就不能產(chǎn)生具有活性的酶。所以，有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒有重組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色。
3．儀器、材料和試劑
無菌超凈臺(tái)，電熱恒溫水浴，分光光度計(jì)，離心機(jī)，移液器，微型離心管等；
菌株：E.coli DH5α
質(zhì)粒：pBluscript KS+DNA 片段的質(zhì)粒以及 pBluscript KS 空質(zhì)粒；
LB培養(yǎng)基；含抗菌素的LB平板培養(yǎng)基（氨芐*，濃度50-100μg／mL，X-gal 20-48μg/ml, IPTG 100 μg/ml。一般將抗生素、X-gal和IPTG配制成1000μl儲(chǔ)備液，用時(shí)按培養(yǎng)基的量再加入）；預(yù)冷CaCl2溶液（0.1mol／L）