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多糖多酚植物RNA快速提取
點擊次數：244 發布時間：2012-9-10
多糖多酚植物RNA快速提取
操作步驟：
提示：
（1） *次使用前請先在漂洗液RW瓶加入量無水乙醇!
（2） 操作前在裂解液RLT中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RLT 中加入10μl β-巰基乙醇。此裂解液現用現配。配好的RLT 4℃可放置一個月。
1. 直接研磨法（推薦）:
a. 新鮮植物組織稱重后取100mg迅速剪成小塊放入研缽（冰凍保存或者液氮保存樣品可直接稱重后取100mg放入研缽）， 加入10體積（1ml）RLT（請確定已加入β-巰基乙醇）和1體積（100μl） PLANTaid 室溫下充分研磨成勻漿，注意應該迅速研磨讓組織和裂解液RLT立刻充分接觸以抑制RNA酶活性。
b. 將裂解物轉入離心管，劇烈搖晃振蕩15秒，13，000rpm離心5-10分鐘,沉淀不能裂解的碎片和結合有多糖多酚的PLANTaid，取450μl裂解物上清轉到一個新離心管。
c. 加入上清體積一半的無水乙醇（0.5體積），此時可能出現沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。
d. 立刻接操作步驟項下3。
2. 液氮研磨法:
a. 取500μl裂解液RLT（已經加入β-巰基乙醇），轉入1.5ml離心管中，加入50μl PLANTaid混勻備用。
b. 液氮中研磨適量植物組織成細粉后，取50mg細粉轉入上述裝有RLT和PLANTaid的離心管, 立即用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。
在56℃溫育1-3分鐘有助于裂解植物,但是淀粉含量高的植物不能溫育,因為提高的溫度可能導致淀粉膨脹。
c. 用帶鈍針頭的一次性 1 ml（配0.9mm針頭） 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到滿意勻漿結果（或者電動勻漿30秒）,可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產量。
d. 將裂解物13，000rpm離心5-10分鐘,沉淀不能裂解的碎片和結合有多糖多酚的PLANTaid, 將所有裂解物上清轉到一個新離心管。
e. 較估計裂解物（上清）體積,加入0.5體積的無水乙醇,此時可能出現沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。
f. 立刻接操作步驟項下3。
3. 將混合物（每次小于700μl,多可以分兩次加入）加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心60秒，棄掉廢液。
4. 加700μl 去蛋白液RW1，室溫放置30秒，12，000rpm 離心30秒，棄掉廢液。
如果DNA殘留明顯,可在加入RW1后室溫放置5分鐘后再離心。
5. 加入500μl漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RW,重復一遍。
6. 將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。
7. 取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據預期RNA產量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加熱效果更好）， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。
8. 如果預期RNA產量>30μg,加30-50μl RNase free water重復步驟7, 合并兩次洗脫液,或者使用*次的洗脫液加回到吸附柱重復步驟一遍（如果需要RNA濃度高）。
洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產量比前者高15–30%,但是濃度要低,用戶根據需要選擇。