一、聚合酶鏈反應(yīng)的歷史回顧
1、核酸體外擴(kuò)增zui早的設(shè)想
由Khorana及其同事于1971年提出：“經(jīng)過(guò)DNA變 性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重視該過(guò)程便可克隆tRNA基 因”。但由于當(dāng)時(shí)很難進(jìn)行測(cè)序和合成寡核苷酸引物，且當(dāng)時(shí)(1970年)Smith等發(fā)現(xiàn)了 DNA限制性內(nèi)切酶，使體外克隆基因成為可能，所以，使Khorana等的早期設(shè)想被人 們遺忘。
2、聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明
1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的人類遺傳研究室 Mullis等人才發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人們夢(mèng)寐以求的體外無(wú)限擴(kuò)增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實(shí)。其原理類似于DNA的體內(nèi) 復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件。開始是使用大腸桿菌 dna聚合酶Klenow片段來(lái)擴(kuò)增人基因組中的特異片段。由于該酶不耐熱，因此，每次 加熱變性DNA后都要重新補(bǔ)加Klenow酶。在操作多份標(biāo)本時(shí)，這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力， 且易出錯(cuò)。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR反應(yīng)更易于自動(dòng)化，繼而PE-Cetus公司推 出了*臺(tái)PCR熱循環(huán)儀，使該技術(shù)的自動(dòng)化成為現(xiàn)實(shí)。Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)于1993年 獲得諾貝爾獎(jiǎng)金。
二、聚合酶鏈反應(yīng)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展
PCR及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展速度是驚人的。上分別于1988年和1990年在美國(guó)和 英國(guó)召開了*屆和第二屆PCR技術(shù)專題研討會(huì)。*屆會(huì)議主要討論了PCR的應(yīng)用 與技術(shù)本身的優(yōu)化問(wèn)題；第二屆會(huì)議的主要議題是人類基因組計(jì)劃與PCR的進(jìn) 展。這充分體現(xiàn)了生物學(xué)家對(duì)PCR的重視。
(表)聚合酶鏈反應(yīng)的相關(guān)技術(shù)
名 稱
主要用途
簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增法
擴(kuò)增未知基因片段
巢居PCR
提高PCR敏感性、特異性，分析突變
復(fù)合PCR
同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變或病原
反向PCR
擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列，致產(chǎn)物突變
單一特異引物PCR
擴(kuò)增未知基因組DNA
單側(cè)引物PCR
通過(guò)已知序列擴(kuò)增未知cDNA
錨定PCR
分析具備不同末端的序列
增效PCR
減少引物二聚體，提高PCR特異性
固著PCR
有利于產(chǎn)物的分離
膜結(jié)合PCR
去除污染的雜質(zhì)或PCR產(chǎn)物殘留
表達(dá)盒PCR
產(chǎn)生合成或突變蛋白質(zhì)的DNA片段
連接介導(dǎo)PCR
DNA甲基化分析、突變和克隆等
RACE-PCR
擴(kuò)增cDNA末端
定量PCR
定量mRNA或染色體基因
原位PCR
研究表達(dá)基因的細(xì)胞比例等
臆斷PCR
鑒定細(xì)菌或遺傳作用
通用引物PCR
擴(kuò)增相關(guān)基因或檢測(cè)相關(guān)病原
信使擴(kuò)增表型分型(mapping)
同時(shí)分析少量細(xì)胞的mRNA
三、其它擴(kuò)增技術(shù)
與PCR及其相關(guān)技術(shù)發(fā)展的同時(shí)，新的擴(kuò)增技術(shù)也不斷誕生。這些技術(shù)各有利 弊，與PCR互為補(bǔ)充，有的可結(jié)合應(yīng)用，共同構(gòu)成了核酸體外擴(kuò)增技術(shù)的大家族。我 們相信，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這一家族一定會(huì)再涌現(xiàn)出新成員。
其它體外核酸擴(kuò)增技術(shù)(表)
技術(shù)
應(yīng)用
轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)
檢測(cè)HIV
連接酶鏈反應(yīng)(LCR)
檢測(cè)點(diǎn)突變
自主序列復(fù)制(3SR)系統(tǒng)
研究RNA，臨床應(yīng)用、法醫(yī)學(xué)等
鏈替代擴(kuò)增(SDA)
檢測(cè)、鑒定基因
Qβ復(fù)制酶系統(tǒng)
增加探針檢測(cè)敏感性
循環(huán)探針?lè)磻?yīng)
增加探針檢測(cè)敏感性
