細胞融合(cell fusion)或細胞雜交(cell hybridization)是指真核細胞通過介導和培養,兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程。人工的細胞融合開始于20世紀50年代, 60年代到70代作為一門新興的技術, 發展非常快, 應用范圍也極為廣泛, 除了同種類細胞間可以融合, 種間遠緣細胞也能融合, 細胞與組織不同, 不排斥異類、異種細胞, 動物細胞如此,植物細胞也是如此。基因型相同的細胞融合成的雜交細胞稱為同核體(homokaryon);來自不同基因型的雜交細胞則稱為異核體(heterokaryon)。
目前, 誘導細胞融合的方法有三種:病毒(Okada, 1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)(Pontecorvo, 1975)和電激(Zimermann, 1980s)。副粘病毒科的病毒,如副流感病毒(Sendai virus)和新城雞瘟病毒,在其被膜中目前發現了兩種糖蛋白。較大的一種具有粘附細胞和凝血的作用;較小的一種可介導病毒同宿主細胞融合, 也可誘導細胞與細胞融合,稱為融合蛋白(fusion protein)。人工利用病毒誘導細胞融合即是利用病毒的這一特性, 使用時先用紫外線將病毒滅活, 稀釋到一定濃度加入到細胞懸液中, 誘導細胞融合。但病毒介導細胞融合方法在使用前需要病毒的繁殖與滅活,操作繁瑣,如滅活不*則易對實驗人員造成傷害,因此現在一般不使用此方法。后兩種方法則是利用化學和物理手段,暫時使質膜脂類分子的有序排列發生改變,待去掉作用因素之后,質膜恢復原有的有序結構,在恢復過程中便有可誘導相接觸的細胞發生融合。總之,這3種方法都是在相互接觸的兩細胞進行自我修復過程中融合的。
細胞融合不僅可用于生物學的基礎理論研究,而且在生產實踐上還有重要的應用價值,如目前在單克隆抗體的制備, 核質關系, 體細胞的遺傳和發育, 新品種的培養, 免疫作用, 疾病的治療和性狀的改良, 潛伏病毒的研究等,已取得了顯著的成績。
1.實 驗 目 的
1.1. 通過PEG介導的雞血細胞融合實驗, 對體細胞融合有一個清楚的概念
1.2. 并初步掌握利用PEG介導動物細胞融合的實驗技術
2.實 驗 原 理
利用PEG介導的動物細胞融合,其實驗原理到目前為止還沒有*定論。學者們一般認為,PEG改變各類細胞的膜結構,使兩細胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發生疏散、進而使其結構發生重排,再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用,引起相臨的重排質膜在修復時相互合并在一起, 使兩細胞的胞質溝通, 從而造成相互接觸的細胞之間發生融合。
利用PEG介導細胞融合, 其融合效果受以下幾種因素的影響。1. PEG的分子量與濃度: 細胞融合效果與PEG的分子量及其濃度成正比;但PEG的分子量越大、濃度越高, 對細胞的毒性也就越大。為了兼顧二者,在實驗時常常采用的PEG分子量一般為1000~4000,濃度一般為40~60%。2. PEG的pH值: 經驗證,PEG的pH值在8.0~8.2之間融合效果。3. PEG的處理時間: 處理時間越長,融合效果越好, 但對細胞的毒害也就越大。故一般將處理時間限制在1分鐘之內。本實驗中細胞融合后無需繼續培養, 故處理時間可適當放寬至數分鐘。4. 融合時的溫度: 由于生物膜膜的流動性與溫度成正比,故細胞的融合效果也與溫度成正比。因此,為了獲得更好的融合效果, 在細胞可能承受的溫度范圍內可適當提高處理的溫度。對于哺乳動物的細, 一般采用的溫度為38~40℃。
本實驗所用材料為雞的血細胞,這是因為: 1. 雞血細胞具有細胞核,便于對融合細胞進行鑒別;2. 實驗材料便宜、易得。細胞融合與否,可通過觀察細胞內核的數目來進行鑒別。細胞內只有一個核,定為未融合細胞;有二至多個核,定為融合細胞。