目的

1．了解稀釋法分離土壤微生物的原理。

2．學習并掌握由土壤分離細菌和真菌的方法。

3，掌握有目的分離有益微生物的原理和技術。

原理

土壤是微生物棲居的大本營，各種各樣的微生物都雜居在一起。當我們需要某種微生物時，即可通過提供適宜的營養條件，或添加只利于所需菌生長而抑制其它菌生長的抑制劑，有選擇地將所需菌分離出來，這種技術即稱為微生物的分離與純化。稀釋法常用于分離土壤、各種水域及基物表面的微生物。其原理是：先將土壤樣品進行一系列倍比稀釋，然后將幾個適當濃度的稀釋液均勻涂布于分離培養基表面。經培養后，土壤中的單個微生物細胞或孢子即可在培養基表面形成肉眼可見的菌落。再將所需菌落轉入試管斜面,然后經平板劃線再次取得單菌落后，即可得到所需菌種的純菌株。因此，本方法的zui大特點是可以對土壤樣品進行活菌計數，同時，如果采用選擇性培養基，可以分離到目的菌株。其全過程見圖24-1。

本方法分離土壤微生物具有一定的局限性，首先，由于采用平板培養，厭氧的微生物不宜在平板上生長，如果需要分離厭氧微生物，還需要厭氧操作裝置。其次，采用的幾種培養基不一定能適于土壤中所有的微生物生長，特別是那些目前尚不能在人工培養基上生長的微生物。本實驗選擇細菌、放線菌和真菌的zui適培養基，對各大類微生物進行分離和活菌計數。

本實驗還針對可以產生纖維素酶的微生物而設計了選擇性分離培養基。分別根據分離目的設計出相應的篩選模型。制備含有不同底物的培養基平板，將稀釋的土壤懸液涂布，或將分離到的菌株直接點接在選擇性平板表面，置適宜溫度培養后，可通過肉眼觀察來判斷目的需要的目的菌株。

材料

1．樣品：過篩（孔徑約2mm）的新鮮土壤樣品（使用前先測定含水量）。

2．培養基：在300ml 三角瓶中分別分裝150ml 牛肉膏蛋白胨培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基和高氏1 號培養基。

3．選擇性培養基：纖維素酶產生菌分離培養基 （選做）

4．滅菌物品：250ml 三角瓶分裝90ml 無菌水（內含20-30 粒玻璃珠），18×180mm 試管分裝9ml 無菌水，培養皿，1ml 吸管，玻璃刮鏟。

方法

1．制備土壤稀釋液：用小天平稱分別稱取少時潮濕的菜園土和風干的菜園土各10g，置于90ml 含玻璃珠的無菌水中，震蕩10min，靜置30 秒后，即得土壤原液（10－1）。再用1ml 無菌吸管吸取1ml 上清液加到9ml 無菌水中，充分搖勻，即得（10－2）稀釋液。依次類推，潮濕土制得10－1 至10－6 稀釋液； 風干土制備10－1 至10－4 稀釋液；

2．分離：

（1）細菌的分離（基內接種）

a.．取9 個無菌平皿，用1ml 無菌吸管分別吸取0.1ml 10－4、10－5 及10－6 潮濕土的土壤稀釋液，接入平皿，每一稀釋度設3 個重復，

b．將已融化并冷卻至45℃左右的細菌培養基倒入無菌培養皿中，每皿約15ml，共9 個平皿，與菌液充分混勻，凝固后，在平皿上作好培養基種類、稀釋度、組號及日期標記；

c．將平板倒置，37℃培養2~3 天后觀察并計數。

（2）放線菌的分離（表面接種）

a．將已融化的150ml 高氏一號培養基中加入2 滴10%重鉻酸鉀溶液，充分混勻后倒入無菌培養皿中，每皿約15ml，共9 個平皿，凝固后，在平皿上作好培養基種類、稀釋度、組號及日期標記；

b．用1ml 無菌吸管分別取0.1ml 10－3、10－4 及10－5 風干土的土壤稀釋液，接入培養基表面，每一稀釋度3 個重復；

c．用無菌玻璃刮鏟，按稀釋度由高到低順序依次輕輕涂布，不要刮破培養基表面；

d．將平板倒置，37℃培養5~7 天后觀察并計數。

（3）真菌的分離（表面接種）

a．將已融化的150ml PDA 培養基冷卻到50℃左右，加入0.3ml *溶液（1000?/ml），充分混勻后倒入無菌培養皿中，每皿約15ml，共9 個平皿，凝固后，在平皿上作好培養基種類、稀釋度、組號及日期標記；

b．用1ml 無菌吸管分別取0.1ml 10－3、10－4 及10－5 潮濕土的土壤稀釋液，接入培養基表面，每一稀釋度3 個重復；

c．用無菌玻璃刮鏟按稀釋度由高到低順序依次輕輕涂布，不要刮破培養基表面；

d．將平板倒置，26℃~28℃培養3 天后觀察并計數。

結果

1．活菌計數：

計數時通常選用每種微生物生長的zui適稀適度的三個平皿計數， 如細菌、放線菌和酵母菌以每皿30~300 個菌落為宜，絲狀真菌則以每皿10~100 個菌落為宜。將原始結果填入下表，根據事先測定的土壤含水量，按公式計算出每個干土中微生物的量。

2．檢查每皿中的優勢菌種，可根據菌落特征、制水壓片、染色制片等觀察菌體形態；

3．純培養：記錄優勢菌株的菌落特征并編號，然后將其劃線接入試管斜面。根據已掌握的知識進行判斷，細菌用牛肉膏蛋白胨培養基，放線菌用高氏一號培養基，真菌用PAD培養基。見圖24-3。分別在相應培養基平板上劃線分離單菌落，待長好后再次劃線接入試管斜面，以備鑒定、保存使用。