1. 從瓊脂平板挑取形態相似的純培養菌落接種肉湯培養基，并于35度培養至濁度達到或超過0.5麥氏單位，取出用鹽水或肉湯調節菌液濃度至0.5麥氏單位，含菌量約（1－2）×108cfu/ml。也可將菌落直接懸浮于無菌鹽水或肉湯內，調至0.5麥氏單位，這稱為直接菌懸液法。

2. 用無菌棉拭子浸入調好的菌懸液中，將多于菌懸液在管壁擠出，在M-H瓊脂平皿上劃線，劃滿整個瓊脂表面，旋轉平皿60°重復劃線共三次，zui后一次用拭子涂抹瓊脂邊緣。置室溫3－5分鐘。

3.用紙片分配器或無菌鑷子取藥敏紙片，貼于平板表面，并用鑷尖輕壓一下紙片，使其貼平。每張紙片的間距不小于24mm，紙片的中心距平板的邊緣不小于15mm，90mm直徑的平板適宜貼6張藥敏紙片。

4. 將貼好紙片的平板置35度孵育18－24h后，用游標卡尺量取抑菌圈直徑。

根據抑菌圈的大小（不同抗生素其抑菌圈大小的標準不一致），判斷為敏感（S），耐藥（R）或中介度（I）。

某些細菌可蔓延生長至某種抗生素的抑菌圈內，如磺胺藥抑菌圈內可能有微量的細菌生長，可忽略不計，應以外圈為準。