原理
以醋酸纖維薄膜為支撐物,浸入pH8.6的緩沖液后吸去多余液體。將微量血清點于膜上,電泳后,將薄膜置染色液中使蛋白質固定并染色,洗去多余染料。
操作
1. 準備與點樣
(1)將薄膜切成2.5×8 cm 的小片。在薄膜無光澤面(正面)的一端約2 cm 處用鉛筆劃一線,以標明點樣位置。
(2)將薄膜無光澤面向下,漂浮于*緩沖液面上(緩沖液盛于培養皿中),使膜條自然浸濕下沉。
(3)將充分浸透(膜上沒有白色斑痕)的膜條取出,用濾紙吸去多余的緩沖液,把膜條兩端各貼于兩塊玻片上使點樣線架空。
(4)用血色素吸管吸取新鮮血清3~5 ul,涂于載玻片末端處,或用載玻片在血清上蘸一下,使載玻片下端粘上一薄層血清,然后緊按在薄膜點樣線上,待血清全部透入膜內,移開載玻片。
2. 電泳
將點樣后的膜條置于電泳槽架上,放置時,無光澤面(即點樣面)向下,點樣端置于陰極槽架上以四層濾紙作橋墊,膜條與濾紙需貼緊,待平衡5分鐘后通電,電壓為110 V,電流為0.4~0.6 mA/cm,通電1小時左右關閉電源。
3. 染色
通電完畢后用鑷子將薄膜取出,直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中,染5分鐘取出,立即浸入盛有漂洗液的培養皿中,反復漂洗數次,直至背景漂凈為止。用濾紙吸干薄膜。
4. 定量
本實驗不要求進行定量分析,如有需要,可采用薄層掃描儀進行掃描定量,或采用洗脫后再進行比色的方法進行定量。
5. 計算
光密度總和T=A+α1+α2+β+γ
各部分蛋白質的百分數為:
臨床意義
1. 正常值:白蛋白57~72%,α1球蛋白2~5%,α2球蛋白4~9%,β球蛋白6.5~12%,γ球蛋白12~20%。
2. 肝硬化時白蛋白顯著降低,γ球蛋白升高2~3倍;腎病綜合癥時白蛋白降低,α2和β球蛋白升高。
試劑與器材
1. 電泳儀:包括直流電源整流器和電泳槽兩個部分,電泳槽用有機玻璃或塑料等制成。它有兩個電極,用白金絲制成。
2. *緩沖液,pH8.6,離子強度0.06
*鈉12.76 g,*1.66g于蒸餾水中加熱溶解后再加水至1000ml。
3. 氨基黑10B染色液
氨基黑10B0.5 g,甲醇50 ml,冰醋酸10 ml,蒸餾水40 ml。
4. 漂洗液配法
95%乙醇45 ml,冰醋酸5 ml,蒸餾水50 ml 混勻。
注意事項
1. 醋酸纖維薄膜電泳分析血清蛋白的正常結果不同于紙上電泳,主要是白蛋白偏高,個別正常人白蛋白僅超過70%。α1,α2,和β,γ都偏低,個別正常人γ球蛋白可低到12%左右。上述正常值僅供參考。
2. 經電泳,染色之干燥膜浸于冰醋酸:95%乙醇(2∶8)溶液中20分鐘,取出后將薄膜平貼于玻璃板上。干燥過程中,薄膜漸變透明。此透明薄膜可用掃描光密度計繪出電泳曲線,并可根據曲線的面積計算各組分的百分數。目前國內已有自動定量的光密度計生產。此透明薄膜可長期保存,供教學示教用。
附:遷移率是膠體顆粒的一個物理常數,可用來鑒定蛋白質等物質以及研究它們的某些理化性質。現將人血漿蛋白質的等電點,遷移率等列于下表,供分析參考。