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利用密度梯度方法進行核糖體分離
點擊次數：6251 發布時間：2012-10-8
核糖體是細胞內蛋白質合成的場所，也是細胞中含量zui多的RNA-蛋白質復合體，在真核生物中數目龐大。核糖體除參與蛋白質合成外，還與細胞的生長、分化、細胞壽命、胚胎發育以及癌癥的發生有關，在快速生長的酵母細胞中，細胞花費了大部分的能量用于產生、組裝成熟核糖體的相關成分，與核糖體生物發生相關基因的轉錄占到整個細胞轉錄體系的60%以上。
除此之外，還可通過對核糖體的研究間接了解到某些基因的表達活性或在不同的脅迫條件下，特定基因在細胞內表達量的變化。通過結合于核糖體亞基和多聚核糖體上的RNA，利用qRT-PCR技術，可以直接了解到基因的表達活性。如何實現核糖體的分離，獲得相關信息成為了核糖體研究的關鍵。以下為利用密度梯度方法進行核糖體分離的相關流程及方法，可供核糖體研究的相關人員參考。
在密度梯度液的制備過程中，由于層鋪法產生的是點梯度，分離效果差，故采用Biocomp公司生產的全自動密度梯度制備儀進行*線性密度梯度溶液的制備。在SW41離心管中先加入1/2體積10%蔗糖溶液，再由針頭插入底部加入1/2體積45%蔗糖梯度液（每個梯度液加入量以Biocomp提供的標尺為準），放置于Biocomp梯度制備儀中，選擇相應的內置程序（轉子為SW41，梯度介質為蔗糖，梯度范圍為10-45%）運行，便可直接獲得10-45%*線性蔗糖梯度溶液。
關于細胞樣品的處理，以培養的Hela細胞為例，先用PBS（pH 7.4）洗兩次，然后加入細胞裂解緩沖液，緩沖液包含50mM Tris-HCL，100mM KCL（或NaCl），5mM MgCl2，1mM DTT，100ug/ml cycloheximide（環己酰亞胺），40U/ml RNasin，以及1% NP-40和1% sodium deoxycholate（脫氧膽酸鈉）。
裂解后的細胞，首先對細胞裂解液進行預離心，4℃，10000-13000rpm離心10min，然后取上清液上樣于10-45%蔗糖密度梯度溶液中，梯度液包含20mM Tris-HCl（pH 7.5），5mM MgCl2, 100mM NaCl以及50ug/ml cycloheximide。對于核糖體的分離多依據各組分的沉降系數的不同，因此采用速度區帶離心方法。放置離心管于Beckman超速離心機中，轉速36000-40000rpm，4℃離心2-3h，使得核糖體亞基及多聚核糖體在梯度溶液中得到分離。
核糖體分離后的收集及繪圖，手動方法收集易產生分層的擾動，且無法繪制吸收峰圖。故采用Biocomp全自動密度梯度分離系統進行收集，結合紫外檢測器，檢測樣品在260nm處的吸收，實時繪制吸收峰圖。利用餾分收集器進行分管收集樣品，通過吸收峰圖對應的離心管號，便可以直接獲得各核糖體亞基或多聚核糖體上的RNA，結合qRT-PCR等技術可進行進一步相關研究。
參考文獻：
1. Adam Amsterdam, Kirsten C. Sadler and Kevin Lai et al.2004 Many Ribosomal Protein Genes Are Cancer Genes in Zebrafish. PLoS Biology 2（5）: e139. doi:10.1371/journal.pbio.0020139
2. Emiliano P. Ricci, Fabrice Mure and Henri Gruffat et al. 2009. Translation of intronless RNAs is strongly stimulated by the Epstein-Barr virus mRNA export factor EB2. Nucleic Acids Research, 37（15）:4932-4943
3. Lakshmi Reddy Palam, Thomas D. Baird and Ronald C. Wek. 2011. Phosphorylation of elF2 Facilitates Ribosomal Bypass of an Inhibitory Upstream ORF to Enhance CHOP Translation. The Journal of Biological Chemistry, 286（13）:10939-10949
4. Marie-Cecile Didiot, Murugan Subramanian and Eric Flatter et al. 2009. Cells Lacking the Fragile X Mental Retardation Protein（FMRP） have Normal RISC Activity but Exhibit Altered Stress Granule Assembly. Molecular Biology of the Cell, 19,428-437
5. Ruiqing Yang, Sergei A. Gaidamakov and Jingwei Xie et al. 2011. La-Related Protein 4 Binds Poly（A）, Interacts with the Poly（A）-Binding Protein MLLE Domain via a Variant PAM2w Motif, and Can Promote mRNA Stability. Molecular and Cellular Biology, 31, 542-556
6. Takao Mori, Chiharu Ogasawara and Toshifumi Inada et al. 2010. Dual Functions of Yeast tRNA Ligase in the Unfolded Protein Response: Unconventional Cytoplasmic Splicing of HAC1 Pre-mRNA Is Not Sufficient to Release Translational Attenuation. Molecular Biology of the Cell, 21,3722-3734