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mRNA為單股,一般會卷繞成特定的三級結構,并與某些蛋白質結合,而以messenger ribonucleoprotein particles (mRNPs) 的型式存在于細胞內;自細胞抽取RNA時,一般會以特定步驟去除蛋白質,但仍難*破除RNA的二/三級結構。 由于進行電泳分析時,影響核酸泳動速率的因子主要包括核酸的長度與構形 (conformation),為了去除核酸構形所造成的影響,一般以電泳分析RNA時都采用變性膠體電泳;在進行這一類電泳分析時,由于RNA已經被變性 (denature),影響其泳動速率的因子主要是長度。 一旦RNA以變性膠體電泳解析好,即可進一步進行北方轉印與雜合分析。
在進行RNA變性膠體電泳分析時,如果所要分析的RNA比較小 (<1,000 bases),可以選用聚丙烯酰胺膠體 (polyacrylamide gel),此時所使用的變性劑 (denaturing reagent) 主要是尿素 (urea);這個方法一般也被用來分析核酸定序反應的產物。若所欲分析的RNA 分子較大, 可采用變性洋菜膠體電泳 (agarose gel electrophoresis),所使用的變性劑為 (1) glyoxal/dimethyl sulfoxide (DMSO) 或 (2)甲醛。 以glyoxal/DMSO系統進行電泳分析時,所使用的電泳緩沖液為10 mMsodium phosphate buffer (pH 7.0);為了避免電泳進行過程中,電泳槽兩邊的pH落差過大,以致影響電泳的進行,能在兩極的間加裝電泳緩沖液循環裝置,而且核酸泳動速率也應盡量放慢。以甲醛為變性劑時不會有這些問題,因此操作比較省事,但必須注意,甲醛氣體為有毒物質,配制甲醛洋菜膠體及進行電泳分析時應在抽氣櫥里操作。 本實驗將采用甲醛洋菜膠體電泳法。
清理電泳槽:能否將RNase去除干凈是RNA相關實驗成功與否的主要決定因子。在進行RNA電泳分析時,為了避免RNase可能帶來的問題,實驗室內能騰出一套電泳器材,專門用于RNA的分析。如果所使用的電泳槽及鑄膠器一般也用于進行DNA分析的話,在進行RNA變性膠體電泳分析前應仔細地加以清理;清理時除了以中性清潔劑*沖洗干凈外,再用3%過氧化氫 (H2O2) 浸泡10 min。
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