方法步驟:
1) 經BamHI 及HindIII 作用的pBlueGus 及pQE31,置65℃水浴10 min,移至冰浴降溫后,以含EtBr 的1.0% agarose gel 進行電泳。
2) NA 45 以滅過菌的剪刀剪成適當大小,置于培養皿中,以10 mM EDTA-8.0浸泡處理10 min,繼以0.5 M NaOH 處理5 min。 以無菌水快速清洗五、六次后,浸泡于無菌水中,置于4℃可保存數周。
3) 電泳后的膠片以EtBr 染色后,以長波長UV 燈觀察DNA 片段所在位置,并在DNA 色帶前后切一刀,以扁平藥匙輔助將NA 45 插入DNA 前后的切縫中;再以UV 燈觀察NA 45 插入的位置是否恰當。
4) 將膠片置回電泳槽中,以100 V 進行電泳約10 min (時間隨NA 45 位置與DNA 距離而定);以UV 燈觀察DNA 是否*吸附到NA 45。
5) 將NA 45 取出,浸于NET中漂洗以去除附著于NA 45 的膠體 (可用微量移液器頭末端將膠體輕輕去除),再移置于微量離心管中 (每2~3 片置于一管中),吸去多余的液體。
◆ 注意! 不可讓NA 45 干掉,否則DNA無法被溶離下來。
6) 加入0.3 mL high salt NET,于68℃加熱40 min,其間不時震蕩。
◆ NA 45 膜片避免重迭在一起,并且必須*浸泡于溶液中。
7) 將溶液吸出,原管中的NA 45 再加入300 μL high salt NET,于68℃加熱10min。
◆ 以下的步驟常容易出錯,請務必分清楚離心后該取上層或下層溶液,請先保留各部份的溶液,確定無誤后再丟棄。
8) 將兩次溶離液合并,加入等體積的n-butanol,震蕩混合,以12,000 rpm 離心5 min。離心后應可分為兩層,DNA 溶液在下層。仔細觀察管底是否有沉淀,吸取下層溶液至另一離心管,避免吸到沉淀。 這時DNA 溶液體積應該減少,可以把兩管或三管的溶液合并成一管。
◆ 溶離后的NA 45 請以UV 照射檢查是否仍有DNA 殘留。
9) 加入等體積的PCI,震蕩混合,以12,000 rpm 離心5 min。
10) 吸取上層水溶液至另一離心管,原管中加入等體積的TE-8.0,混合均勻,以12,000 rpm 離心2 min。將上層液吸出。
11) 合并上層液,加入等體積CI,震蕩混合,以12,000 rpm 離心2 min。
12) 將上層溶液吸出,加入0.2 倍體積的10 M NH4OAc,2.5 倍體積的酒精,置 -20℃沉淀至少 30 min。
13) 以12,000 rpm離心20 min (4℃),沉淀以 -20℃預冷的70%酒精洗兩次,以同轉速離心2 min。
◆ 倒掉上清時請小心,不要讓沉淀流失! 沉淀通常很少,且因純度高,沈淀幾近透明,不易察看;上清吸到另一微量試管中暫時保留。
14) 沉淀干燥后溶于20 μL TE-8.0 中。
15) 取一個直徑3 cm 的培養皿,加入5 mL TE-8.0。以平端鑷子小心夾取VSWP濾膜,將濾膜的光亮面朝上置于液面上。 將溶離的DNA 溶液加在膜上,靜置透析至少30 min 以去除殘留的鹽。
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