方法步驟:
◆ 注意!進行這一部份實驗的前,請先確定pBlueGus/HindIII 與pBlueGus/BamHI 兩者的酵解反應都已經*。
1) 于酵解反應 #1 與 #2 的微量離心管分別加入182 μL 去離子水。
2) 以200 μL PCI 萃取一次,亦即加入PCI 后,以Vortex 震蕩混合,并在室溫離心3 min。
3) 以微量移液器P200 將上層液移至新的微量離心管。
4) 加入等體積的CI,以Vortex 充分震蕩混合,并在室溫離心3 min。
5) 以微量移液器P200 將上層液移至新的微量離心管。
6) 加入0.1 倍體積的3 M NaOAc (pH 5.2) 及2.5 倍體積酒精。
7) 置于 -20℃過夜,或于 -80℃放置30 min,以便沉淀DNA。
隔天:
1) 自冷凍柜取出微量離心管,以14,000 rpm 離心10 min。
?? 注意: 請利用這一段時間參照『基本操作技術』所描述的步驟準備一片1.2%洋菜膠體。 Ethidium bromide 是一種強力致癌物質,嚴禁戴著手套到處亂摸!
2) 小心地倒出上清液。
3) 徐徐加入0.5 mL的70%酒精 (預先放在 -20℃預冷)。小心不要動到DNA沈淀。
4) 以14,000 rpm 低溫離心5 min 的后,倒去上清液,并將微量離心管倒置于一張干凈的衛生紙上30 min,以便風干DNA。也可以用SpeedVac 干燥DNA,但應小心處理,以免DNA 沉淀不見了。
5) 以10 μL dH2O/DEPC溶解DNA。
6) 依照下表,自pBlueGus/BamHI 與pBlueGus/HindIII 各取1 μL DNA 以洋菜膠體電泳進行分析,并估算其濃度。
?? DNA 濃度的估算請以 ??DNA/HindIII 量為參考值。
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