1．從新鮮（時間不超過1周）的2YT／tet平板上挑取單個大腸桿菌SS320的克隆，接種到lml 2 YT／tet培養基中。37℃200r／min孵育6～8小時。轉移培養基到含有50m1 2YT／tet培養基的500ml帶塞錐形瓶中。37℃200r／min培養過夜。
2．將5m1過夜培養基接種于分別含有900m1超級肉湯／tet培養基的6個2L帶塞錐形瓶中。37℃200r／min培養細胞至OD600＝0。6-0．8（3-4小時）。
3．冰上冷卻3個錐形瓶5分鐘，間歇渦旋混勻。
注意：下面的步驟應該在4℃冷室，冰上完成，并且使用預冷的試劑和儀器。
4．用GS3轉子（5000g）4℃55000r／rain離心細胞5分鐘，使用可以迅速降速的離心機（例如Sorvall RC5B Plus），棄去上清。將剩下3個錐形瓶中的培養基（當*組正在離心時，它們應該處于冷卻環境下）加入到相同的管子中，重復離心并棄去上清。
5．用pH 7．4，1．0mmol／L的Hepes裝滿每個離心管。加入一個無菌的磁性轉子到每管中以促進沉淀重懸。簡短地渦旋振蕩沖下管壁上的沉淀并以一個溫和的速度攪拌至沉淀*重懸。
6．用GS3轉子4℃55000r／min離心10分鐘，棄去上清。在傾倒過程中，將攪拌棒留在離心管中，使其留在與沉淀相反的一面。 當從轉子中取出離心管時， 小心維持離心管的角度以免攪亂沉淀。
7．用同樣體積的1．Omm01／L的Hepes（如第5步）重懸細胞。用GS3轉子4℃S5000r／min離心10分鐘，棄去上清。用150mll0％超純甘油重懸每個沉淀。不要把沉淀混在一起。
8．用GS3轉子4℃55000r／min離心細胞15分鐘。棄去上清并拿走攪拌棒。用移液器去掉剩余的少量上清。每管加入3．Oml 10％超純甘油并用移液器重懸沉淀。轉移懸浮液到另外一管并重復操作，使所有沉淀都重懸浮。
9．將350ul的一份分裝于1．5m1微型離心管中的液體快速冰凍。這個實驗方案能制備約12m1濃度為3×1011cfu／ml的細胞。