埃茲蛋白抗體相關信息

Western bloting要注意的一些問題
1、為了讓實驗更加嚴謹有說服力都要設計對照實驗，對照分為：陽性對照（有標準品（比如β-actin，GAPDH）或陽性血清）；陰性對照（測血時用相應小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對照（不加一抗，用PBS代替）；無關對照（用無關抗體）
2、一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇zui適當的比例，一抗二抗的選擇直接影響實驗結果以及背景的深淺。
3、實驗設計時所釆用的抗原批次要一樣，盡量的避免人為的帶來個體差異。特別在做裂解液時更要注意所釆用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實驗帶來不確定性。
4、凝膠的質量直接影響以后的實驗結果，要特別注意幾點：凝膠要均一沒有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過多，太多會導致膠易脆裂；拔梳子時要快，盡量保證點樣孔平整。
5、電泳、轉膜時特別要注意正負極，電壓電流都不能過高；轉膜時“三明治”的疊放次序不錯，同時要防止產生氣泡；盡量讓電轉溫度保持在10度以下，冰浴為宜。
6、封閉時一般在室溫下2h就夠了，但是要注意如果是*標記的二抗就不宜用牛奶，因為牛奶中含有*，用BSA效果更好。
7、加一抗二抗要嚴格保證反應時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；還要注意一抗二抗的匹配。
8、在顯色發光時要特別注意二抗所對應的顯色方法，特別是在發光時要注意發光時間和顯影時間的控制，以看得清楚目的條帶為標準。
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四、Western bloting在抗體生產中的應用
     Western bloting是用來對蛋白質進行檢測的一種常用方法，通過抗原抗體的免疫反應可以定量測出抗體的相對分子量，以及抗體的相對豐度或與已知抗原的關系等等。目前它應用在多個領域,在臨床上檢測傳染病和自身免疫病、過敏癥等，在抗體生產領域它與ELISA、ICC、IHC、IFA等免疫技術相接合已成為單克隆抗體生產的主要篩選手段。
     在單抗的篩選過程中通常釆用幾中免疫技術并存的方式進行篩選，針對不同的抗體釆用不同的技術，有利于提搞抗體生產的篩選效率，下面就針對幾種常用的方法與Western blot進行比較：
方法        ELISA        WB        IHC/ICC        免疫熒光（IFA）
操作        簡單，周期短        復雜，周期長        較簡單        較簡單（要專門的熒光顯微鏡）
靈敏度        高，易產生假陽性        高，特異性高        較WB低        較ICC高
交叉        有.        有，易識別（根據抗原分子的大小）        有，難識別        有
準確度        定性        定性定分子量        定位        定位
載體        酶標板        凝膠、膜        玻片        玻片
結果        普通顯色        化學化光/普通顯色        普通顯色        熒光
在抗體檢測中Western bloting經常要注意到目標抗體與抗原（細胞/組織裂解液）的接合能力，特別是交叉現象，所以一定要設置好對照實驗。同時還有測血、測母克隆亞克隆過程中一定要注意抗體的稀釋倍數以及二抗的使用等等。
總而言之，做Wetern bloting實驗熟練撐握原理和操作是前提，關鍵是統籌整個實驗流程，合理安排，注意細節，這樣才能保證實驗的性和準確性。