抗大腸埃希氏菌O157抗體，Anti-E.coli O157

 （一）操作步驟
1．DEAE-Sephadex
A-50預(yù)處理 　稱DEAE-SephadexA-50（下稱A-50）5g，懸于500ml蒸餾水內(nèi)，1h后傾去上層細(xì)粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH 15ml的比例，將A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，攪勻，靜置30min，裝入布氏漏斗（墊有2層濾紙）中抽濾，并反復(fù)用蒸餾水抽洗至pH呈中性；再以0.5mol/LHCl同上操作過程處理，zui后以0.5mol/LNaOH 再處理一次。處理完后，將A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中過夜 。
2．裝柱
（1）將層析柱垂直固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開關(guān)。
（2）將0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的A-50。等A-50。等A-50凝膠沉降2～3cm高時(shí)，開啟出水口螺旋夾，控制流速1ml/min，同時(shí)連續(xù)倒入糊狀A(yù)-50凝膠至所需高度。
（3）關(guān)閉出水口，待A-50凝膠*沉降后，柱面放一圓形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口。通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。
3．平衡 　　
啟開出水口螺旋夾，控制流速12～14滴/min。使約2倍床體積的洗脫液流出。并以pH計(jì)與電導(dǎo)儀分別測定洗脫液及流出液之pH值與離子強(qiáng)度，兩者達(dá)到一致時(shí)關(guān)閉出水口，停止平衡。
4．加樣及洗脫   
啟開上口橡皮塞入下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當(dāng)柱面液體與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉出水口，以毛細(xì)滴管沿柱壁加入樣品（體積應(yīng)<床體積2%，蛋白濃度以<100mg為宜）。松開出水口螺旋夾使面樣品緩慢進(jìn)入柱內(nèi)，至與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2～3次；再放開出水口，使洗液進(jìn)入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)毫升洗脫液，緊塞柱上口，使整個(gè)洗脫過程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速12～14滴/min。
5．收集 　
開始洗脫的同時(shí)就以試管進(jìn)行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。
6．測蛋白 　　
以751型紫外分光光度計(jì)分別測定每管OD280nm, 與OD260nm,按公式計(jì)算各管蛋白含量 。并以O(shè)D280nm為縱座標(biāo)，以試管編號為橫座標(biāo)，繪制洗脫曲線。
7．合并、濃縮　 
將洗銳峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進(jìn)行合并，以PEG（MW6000）濃縮至所需體積，加入0.02%NaN3防腐，于4℃保存?zhèn)溆谩ｉL期保存時(shí)應(yīng)貯于-40℃冰箱。
8．A-50凝膠的再生　　 
在柱上先以2mol/LNaCl洗脫蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過程將A-50再處理一遍即達(dá)到再生。近期用時(shí)泡于洗脫緩沖液中4℃保存；近期不用時(shí)，以*洗2次，再置50℃溫箱烘干，裝瓶內(nèi)保存。
抗大腸埃希氏菌O157抗體，Anti-E.coli O157 （二）注意事項(xiàng)
（1）柱的選擇：從理論上說，只要柱足夠長，就能獲得理想的分辨率，但由于層析柱流速同壓力梯度有關(guān)，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使流體流動的不均勻性增加，分辨率明顯下降。
（2）純化過程必須嚴(yán)格控制緩沖液的pH及離子強(qiáng)度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液*平衡后，才能進(jìn)行柱層析。
（3）所裝的柱床必須表面平整，無溝流及氣泡，否則應(yīng)重裝。
（4）洗脫過程中應(yīng)嚴(yán)格控制流速，切勿過快。
（5）上樣的體積要小，濃度不宜過高。
（6）加樣及整個(gè)洗脫過程中，嚴(yán)防柱面變干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 親合層析純化 
IgG及IgG亞類