熒光素標(biāo)記金屬蛋白酶組織抑制因子-4抗體IgG，Anti-TIMP-4/FITC

抗體的制備——多克隆抗體的制備 
*動物的選擇 
*佐劑（adjuvant） 
*免疫方法 
*免疫劑量 
*抗體效價的測定 
*放血或定期抽血 
（1） 動物的選擇 
選擇什么動物來免疫取決于： 
*所需抗血清的量 
-小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供幾升。 
*能供免疫用的抗原量 
g足夠，而山羊需要幾毫克。m-小鼠50 
（1） 動物的選擇（續(xù)） 
*動物的品系：免疫動物與提供抗原的動物之間的種系差異越大越好。 
-例如哺乳動物的抗原可選擇非哺乳動物來制備抗體。 
-常用的動物有兔、羊、馬、豬等，以兔（新西蘭兔，年輕，健壯，體重在2.5kg左右，雄性）為zui常用。 
（2） 佐劑 （adjuvant） 
*一般可溶性抗原注射后，迅速從注射部位擴散、吸收代謝。佐劑可延長潴留時間，且延長免疫刺激作用。因此在制備抗體的過程中，常將抗原和佐劑一起注射。 
*zui常用的佐劑是弗氏佐劑，又分為: 
-弗氏不*佐劑（Freund's incomplete adjuvant） 
-弗氏*佐劑（Freund's complete adjuvant） 
弗氏不*佐劑 
（Freund's incomplete adjuvant, FIA） 
*是由油劑（石蠟油或植物油）與乳化劑（羊毛脂或Tween80）混合而成，比例為1:1、2:1、3:1或5:1，可根據(jù)需要而定，通常2:1。 
*使用時與水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐劑中形成油包水乳劑。 
弗氏*佐劑 （Freund's complete adjuvant, FCA） 
*在弗氏不*佐劑中加入活卡介苗或死的結(jié)核分枝桿菌（終濃度為2～20mg/ml），即成為FCA。 
*免疫動物時，將弗氏佐劑與抗原按體積 1:1 混合乳化后（油包水）注入動物。 
-一般注射時用*佐劑乳化，第二次或第三次注射時用不*佐劑或不用佐劑。 
佐劑與抗原乳化的方法 
*研磨法：適于制備大量的佐劑抗原 
-先將不*佐劑加熱，取1.73ml放人無菌玻璃研缽內(nèi)；緩緩滴入0.23ml活卡介苗，邊滴邊按同一方向研磨，使菌體*分散。 
-按同樣方法滴人抗原，每加一滴應(yīng)研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，應(yīng)成為乳白色粘稠的油包水乳劑。 
*缺點：研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大，對微量或難得抗原不宜采用。 
佐劑與抗原乳化的方法（續(xù)） 
*注射器混合法 
-將等量的*佐劑和抗原分別吸人兩個5ml注射器內(nèi)，然后插入三通管內(nèi)，交替推動針管混勻，往復(fù)操作直至形成粘稠的乳劑為止。 
*優(yōu)點：無菌操作，節(jié)省抗原或佐劑。 
*缺點：不易乳化，時間長。 
佐劑與抗原乳化的方法（續(xù)） 
*快速乳化法：利用超聲波粉碎器可快速乳化抗原和佐劑混合物。 
-將抗原和佐劑按所需量加入一離心管中，置于超聲波粉碎器上，粉碎頭浸入液面下 0.5cm，離瓶底0.5cm左右，以免打碎離心管。 
-每次乳化 10～15s，然后置冰箱lmin左右。反復(fù)乳化3～4次即可*乳化。管內(nèi)殘余量800r/min離心5～10min收集。 
*優(yōu)點：簡單、快速、節(jié)省材料。 
乳化劑的鑒定 
*判斷乳化是否充分，可將一滴乳化好的液體滴在水面上（冷水中），如能長時間保持圓珠形而不散開，表示乳化達(dá)到要求。 
（3） 免疫方法——免疫途徑 
*常有靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)、淋巴結(jié)、腳掌等注射。 
*一般采用多點注射方法 
-常在足、掌、腋窩淋巴結(jié)周圍、背部兩側(cè)、頜下、耳后等處的皮內(nèi)或皮下。 
-皮內(nèi)易引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，有利于提高抗體的效價。 
（3） 免疫方法——免疫途徑 （續(xù)） 
*幾點說明： 
-大動物一般不用腹腔注射 
-顆粒抗原和使用佐劑時不能靜脈注射 
g抗原即可獲得較好的免疫效果。m-抗原寶貴可采用淋巴結(jié)內(nèi)微量注射法，只需10～100 
-皮內(nèi)注射較困難，特別是天冷時更難注入。 
（3） 免疫方法——次數(shù)及間隔時間 
*次數(shù)一般為2～3次（初次免疫和加強免疫） 
-注射后，10～15天再加強注射； 
-劑量同或為的一半，用不全佐劑或不用佐劑。 
*間隔時間，一般而言，動物越大，間隔越長 
-豚鼠、大鼠為7～8天，兔子為10～15天，羊為14～28天； 
-第三次注射的間隔時間更長些，效果更好。 
舉例1：家兔的免疫 
*初次免疫 
g Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8點，每點0.1～0.2ml，也可肌肉內(nèi)或皮內(nèi)注射；m-用50～200 
*兩周后，加強免疫 
g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、靜脈或腹腔內(nèi)注射；m-將50～200 
*抗體效價的檢測：加強免疫一周后，耳緣靜脈采血 
-抗體效價測定可用環(huán)狀沉淀試驗、瓊脂雙向擴散法等方法。前者抗體效價在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清進一步提純。 
舉例2：微量抗原淋巴結(jié)內(nèi)注射免疫家兔 
*一般選擇2.5～3.0kg的新西蘭種公兔 
-先在其兩腳墊注射*福氏佐劑0.2ml（卡介苗每兔合5mg）； 
-10天后，見胭窩淋巴結(jié)腫大，然后將抗原注射至腫大的淋巴結(jié)內(nèi)，*次注射抗原用*福氏佐劑混合乳化； 
g；m-以后每隔20天用不*福氏佐劑乳化抗原，以同樣方法加強2次，各次注射的抗原均為25～50 
-末次注射兩周后兔耳放血測價 （可達(dá)1:128）。 
舉例3：豚鼠和大鼠的免疫 
*初次免疫 
g Ag加入FCA，在背部皮內(nèi)注射4～6點，每點 0.lml，也可肌肉內(nèi)或皮下注射；m-用10～100 
*加強免疫 
g Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或靜脈注射；m-每隔 7～8天，將10～50 
*抗體效價的檢測 
（4） 免疫劑量 
*抗原性強的抗原量應(yīng)小，過大反會引起免疫抑制； 
*免疫周期長的動物可少量多次注射，短的可大量少次。 
（4） 免疫劑量 （續(xù)） 
*各種動物免疫抗原劑量和加強免疫的劑量 
（5） 抗體效價的檢測 
多采免疫雙向擴散法