小鼠巨噬細(xì)胞冷凍細(xì)胞活化

1. 冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死 亡。

2. 細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常（例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì)）。

3. 材料

3.1 37 oC 恒溫水槽

3.2 新鮮培養(yǎng)基

3.3 無菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶

3.4 液氮或干冰容器

4. 步驟：

4.1 操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。

4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時(shí) 蓋子易松掉。

4.3 將新鮮培養(yǎng)基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。

4.4 取出冷凍管，立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。

4.5 取出0.9 ml 解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)（稀釋比例為 1:10～1:15），混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1 ml 解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。

4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑（例如DMSO 或glycerol），依細(xì)胞種類而異， 一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

4.7 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)

1. 細(xì)胞生長至高密度時(shí)，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細(xì)胞種類而異。

2. 材料：

2.1. 無菌磷酸生理緩沖液（Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010）

2.2. trypsin-EDTA solution （0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062）： 以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于–20 oC，使用前放在37 oC 水槽回溫。

2.3. 新鮮培養(yǎng)基

2.4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶

3. 步驟：

3.1. 附著型胞（adherent cell）

3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。

3.1.2. 用D-PBS 洗滌細(xì)胞一至二次。

3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液（1ml/25cm2, 2ml/75cm2），37 oC 作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉trypsin-EDTA 溶 液。（若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清 之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。）

3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

3.2. 懸浮型細(xì)胞（suspension cell）

3.2.1. 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。

3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

3.3. 融合瘤（hybridoma）

3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會(huì)失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。