人膀胱癌細胞實驗步驟：在超凈臺內，安裝好濾器。

用去離子水溶解1640培養基，并用磁力攪拌器攪拌2 h，使之充分溶解。

在超凈臺內過濾。

分裝到250 mL的玻璃瓶內。

用封口膜封好，-20℃保存，過濾結束時，還要取少許培養基進行菌培，驗證培養基是否是無菌。

胎牛血清的處理：

沒有滅活的血清中含有補體成分，需要將血清在56℃條件下滅活30 min。在水浴鍋內進行，滅活的過程中，要不停地搖晃，使受熱均勻，防止沉淀析出來。

人膀胱癌細胞[實驗步驟]

配制Hanks液，高壓滅菌，4℃保存。稱取*，在冰浴上進行研磨，并加入少量的D-Hanks液，使其呈糊狀，zui后用D-Hanks定容，過濾除菌。

分裝后，-20℃保存。

細胞傳代培養[實驗步驟]

1、準備工作：

1）肥皂洗手，在進行無菌操作前，用75% 的酒精擦拭雙手，注意指間，和指甲周圍。同時，用酒精棉球擦拭超凈臺。

2）將培養液放置室溫，備用。

3）打開超凈臺內的紫外燈，照射20 min。同時，將實驗所需材料也放入超凈臺進行滅菌（血清、培養基除外）

4）倒置顯微鏡下，觀察細胞的狀態，是否已經長滿培養瓶，需要進行分瓶。

2、關閉超凈臺的紫外燈，打開風機。

3、點燃酒精燈，取出刻度吸管，在火焰上略燒，然后，安上吸球待用。

4、在打開培養瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶蓋，打開后，瓶口在酒精燈上過火焰，再用吸管輕輕吸出舊的培養液，注意，吸管不要碰到布滿細胞的培養瓶的側壁。

5、將*加入培養瓶內,顯微鏡下隨時觀察，見到細胞的突起消失，變圓時，立即翻轉培養瓶，吸出*。記住不要消化時間過長，否則，細胞會被*消化掉。

6、加入適量Hanks液或培養基清洗一遍，立即倒掉。

7、加入含有10%血清的培養基，用吹打管吹打，一定要輕輕吹打，使其從瓶壁上脫落分散到培養基中，再補加培養基，按1:3進行分瓶。

然后，用火焰燒培養瓶的瓶口和蓋，再蓋好培養瓶的蓋，放到培養箱中進行培養。

以上介紹的是貼壁細胞的傳代培養方法，對于懸浮細胞的傳代培養方法，只需要將細胞進行離心，1000 rpm，5 min,然后，換入新的培養基即可。

再分裝到不同的培養瓶中進行培養。

不健康的細胞質中有空泡，細胞內有顆粒樣物質，細胞間空隙增大，變形，不規則，失去原有的特點。

是否污染：

傳代或換液24~ 48 h注意觀察細胞是否被污染，污染的細胞培養液變渾濁，鏡下可見有大量菌絲。如果細胞生長緩慢，生長特性改變，胞質內顆粒性物質增多，盡管培養液不變渾濁，考慮可能有支原體污染。污染的細胞立即從培養箱中取走，以免污染其它細胞。

人膀胱癌細胞

實驗四、

細胞凍存與復蘇[實驗步驟]

1. 為了保證細胞良好的狀態，在細胞凍存的前一天使細胞處于對數增長期，同時將細胞換液，次日，按照細胞傳代培養方法，用*消化貼壁細胞，將細胞用培養基沖下來，然后，用50 mL尖底離心管離心，1000 rpm，4min，棄上清，收集細胞。

2. 加入適量的凍存液（10% DMSO 和 90%含有20%血清的IMDM培養基）

3. 分裝到凍存管中，做好標記，標明細胞名稱，保存時間，所用培養基等。

4. 4℃放置30 min；-20℃放置1.5 h； -70℃放置12 h；zui后移到液氮罐中。

細胞的復蘇：細胞的復蘇原則是快速溶化，因為如果緩慢的溶化，會使進入細胞的水分形成冰晶，對細胞造成傷害，因此，在復蘇細胞時，將凍存細胞直接放到37℃的水浴中，使其迅速溶解。在超凈臺內將凍存管內的細胞懸浮液直接倒入小培養瓶或培養皿內，然后，加入3 mL的培養液。次日，觀察細胞生長情況，并更換細胞培養液。