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蘇州艾瑞德生物科技有限公司
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本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物四環素類藥物將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭四環素類藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物四環素類藥物的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應殘留物四環素類藥物的含量。
【試劑盒技術指標】
規 格：96孔/盒
靈 敏 度： 0.05ppb
檢測時間： 75min
樣本檢測下限：
組織樣本（雞、鴨、豬肉/肝、蝦、魚、雞蛋）：
四環素 ………………………………………………0.3ppb
二甲胺四環素 ………………………………………0.3ppb
吡四環素 ……………………………………………0.3ppb
* ………………………………………………0.3ppb
脫甲基*……………………………………… 0.6ppb
*………………………………………………0.6ppb
*……………………………………………0.9ppb
蜂蜜樣本：
四環素……………………………………………… 2ppb
二甲胺四環素……………………………………… 2ppb
吡四環素…………………………………………… 2ppb
* ………………………………………………2ppb
脫甲基*………………………………………6ppb
*………………………………………………4ppb
*……………………………………………6ppb
交叉反應率：
四環素 ……………………………………………*
二甲胺四環素…………………………………… 125%
吡四環素 ………………………………………… 110%
* …………………………………………… *
脫甲基*…………………………………… 35%
* …………………………………………… 58%
* …………………………………………… 45%
樣本回收率：
組 織 …………………………………… 85%±20%
蜂 蜜 …………………………………… 75%±20%
【試劑盒組成】
1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）
2、 標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
3、 酶標記物 12ml…………………………紅色帽
4、 抗體工作液 7ml ………………………藍色帽
5、 底物A液 7ml ………………………白色帽
6、 底物B液 7ml ……………………黑色帽
7、 終 止 液 7ml ……………………黃色帽
8、 20X濃縮洗滌液40 ml ………………白色帽
9、 5X 濃縮復溶液 50ml •……………… 透明帽
【 酶標免疫分析程序】
??測定前應須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3、 在ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的*性，正確的洗板操作是ELISA 測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
??操作步驟：
1、從2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 配制標準液
制備四環素標準應用液：50μl 標準濃縮液用
450μl 稀釋好的復溶液稀釋并混合均勻，現配現用。
標準液1：50μl 標準濃縮液1 用450μl 稀釋好的復溶液稀釋 0ppb
標準液2：50μl 標準濃縮液2 用450μl 稀釋好的復溶液稀釋 0.05ppb
標準液3：50μl 標準濃縮液3 用450μl 稀釋好的復溶液稀釋 0.15ppb
標準液4：50μl 標準濃縮液4 用450μl 稀釋好的復溶液稀釋 0.45ppb
標準液5：50μl 標準濃縮液5 用450μl 稀釋好的復溶液稀釋 1.35ppb
標準液6：50μl 標準濃縮液6 用450μl 稀釋好的復溶液稀釋 4.05ppb
3、取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
4、配液：將40ml 20X 濃縮洗滌液用去離子水稀釋至800ml。
5、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6、加標準品/樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗體工作液50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻37℃環境中反應30min。
7、將孔內液體甩干，用已稀釋的洗滌液250μl/孔洗板4～5 次，每次間隔15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、每孔加入酶標記物100μl，蓋板膜蓋板后置37℃環境中反應30min。將孔內液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
9、顯色：加入底物A 液50μl/孔，再加入底物B液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，37℃環境中避光顯色15min。
10、測定：加入終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm 處（建議用雙波長450/630nm 檢測，5min 內讀數），測定每孔OD 值。
【結果判定】
結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含克倫特羅的含量成負相關。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出
其濃度范圍（ng/ml）。假設樣本1 的吸光度值為0.3，
樣本2 的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：
0ppb 為2.243； 0.05ppb 為1.816；0.15ppb 為1.415；0.45ppb 為0.74；1 .35ppb 為0.313；4 .05ppb 為0.155。則樣本1 的濃度范圍是1.35ppb～4.05ppb；樣本2的濃度范圍是0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中四環素實際濃度。
1、定量分析：
所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以*，即百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝ B ×*
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
以標準品百分吸光率為縱坐標，以四環素標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中四環素實際濃度。
若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。
3、標準曲線：
B/B0 （%）
0.05 0.15 0.45 1.35 4.05
四環素（ppb） [µg/kg]
圖1：四環素檢測試劑盒的回歸曲線
4、再現性：
%CV
四環素（ppb） [µg/kg]
圖2：四環素檢測試劑盒的精密度
由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出四環素檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應四環素濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。
【注意事項】
1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。
4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質。
8、 該試劑盒*反應溫度為37℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
【儲存】
原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。
【有效期】
有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。
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