層析柱是凝膠層析技術中的主體，一般用不銹鋼或有機玻璃管。根據樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數不同，從而分離的一種層析法。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外， 直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。 分級分離時柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結果是影響洗脫峰形，出現拖尾出象，降低分辯力。在準確分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。
以中壓柱層析法提取分離冬凌草甲素為例：
1.吸附劑的處理及柱子裝填
將一定量薄層層析硅膠裝入搪瓷盤置于烘箱中，于105。C活化2H后，取出放置室溫即可裝柱。柱子采用干法填充，填滿整個柱體，不留死體積，密封后用柱塞式計量溶劑泵按丙酮一石油醚(5：95)比例泵入溶劑，至溶劑流出止。
2.上樣
將冬凌草的乙醇提取物400G用適量丙酮溶解，泵入中壓柱柱頭，然后泵入石油醚1000RID。
3.洗脫
以一定比例的石油醚一丙酮為洗脫液，60ML/MIN的流速進行梯度洗脫，柱的使用壓力為2～ 3KG/C 。按每份500ML收集，TLC檢識展開劑丙酮一氯仿(2：8)，顯色劑5%濃硫酸乙醇液
至洗脫，相同流份合并，回收溶劑。將冬凌草甲素流份合并蒸干。加入適量甲醇熱溶后自然放置，析出結晶，為冬凌草甲素。
4.層析柱再生、平衡
有效成分經TLC檢識全部流出后，用純丙酮5000ML再生，丙酮一石油醚(5：95)平衡后，可再次上樣，反復使用(使用次數隨原料不同而異，一般可連續使用2—6個月以上)。
5.重結晶
冬凌草甲素結晶析出后，減壓過濾，然后用少量甲醇洗滌(洗滌液保留，作下次熱溶冬凌草甲素用)。將冬凌草甲素再用適量甲醇熱溶后放置，結晶再次析出，待結晶后，抽濾，用少量洗滌，將結晶室溫下晾干后置真空干燥箱中，35度真空干燥至恒重。密封于瓶中，置干燥器中保存。
6.薄層層析分析
取適量冬凌草甲素對照品及由上述方法得到的冬凌草甲素樣品甲醇溶解后點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿一丙酮(8：2)為展開劑進行展開，5% 濃硫酸乙醇液顯色，于105。C烘至斑點清晰。表明在該展開系統下，冬凌草甲素樣品和對照品都具有相同的RF值，并呈現出同樣的藍綠色斑點，在制備的冬凌草甲素樣品中，沒有雜質斑痕。
