適用儀器

樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

1.準(zhǔn)備密度為0.5-1×106細(xì)胞/ mL的細(xì)胞
2.在0.5 mL細(xì)胞懸液中加入1 µL 500X Amplite ROS Green
3.在37℃下將細(xì)胞染色1小時(shí)
4.處理細(xì)胞以誘導(dǎo)ROS
5.使用帶有FL1通道的流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞（Ex / Em = 490/520 nm）

溶液配制

1.儲(chǔ)備溶液配制

       除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。 避免反復(fù)凍融循環(huán)。

Amplite ROS綠色儲(chǔ)備溶液（500X）：將100 µL DMSO（組分C）添加到Amplite ROS Green（組分A）的小瓶中，并充分混合以制成500X Amplite ROS Green儲(chǔ)備液。 避光。 注意：要存放，請(qǐng)密封管。有關(guān)細(xì)胞樣品制備的指南，請(qǐng)點(diǎn)擊查看。

操作步驟

1.對(duì)于每個(gè)樣品，以0.5×105至1×106細(xì)胞/ mL的密度在0.5 mL測(cè)定緩沖液（組分B）或自備緩沖液中制備細(xì)胞。注意：應(yīng)單獨(dú)評(píng)估每個(gè)細(xì)胞系，以確定誘導(dǎo)ROS的細(xì)胞密度。

2.將1 µL 500X Amplite ROS Green儲(chǔ)備溶液加入0.5 mL細(xì)胞懸液中。

3.在37oC下孵育1小時(shí)。注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，用0.5 mM EDTA輕輕提起細(xì)胞以保持細(xì)胞完整，并在與Amplite ROS Green孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。合適的孵育時(shí)間取決于所用的單個(gè)細(xì)胞類(lèi)型和測(cè)試化合物，優(yōu)化每個(gè)實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間。

4.通過(guò)在所需的緩沖液（例如PBS或HBSS）中添加50 µL 11X測(cè)試化合物來(lái)處理細(xì)胞。對(duì)于對(duì)照孔（未處的細(xì)胞），添加相應(yīng)量的緩沖液。

5.將細(xì)胞在37oC下孵育，以誘導(dǎo)ROS（避光）。注意：我們?cè)?7℃下用100 µM TBHP（氫過(guò)氧化叔丁基）處理Jurkat細(xì)胞30分鐘，以誘導(dǎo)ROS。有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參見(jiàn)圖1。

6.使用具有FL1通道（Ex / Em = 490/520 nm）的流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。