百螢問號：Western Blot實驗中常見問題解答

時間：2024/3/25閱讀：125

Western 免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測的實驗。在WB 實驗中常會出現各種問題，而拖慢實驗速度，使實驗達不到理想的效果。今天百螢跟各位同學一起分享下 WB 實驗中各種問題及問題建議。

常見問題	可能原因	建議
電泳條帶成笑臉狀	膠不均勻冷切，中間冷卻不好，電泳系統溫度偏高	減少電壓減慢電泳速度，在冷室或者冰浴中進行電泳
電泳條帶成皺眉狀	可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不w全	調整裝置
拖尾	樣品溶解不好	樣品充分溶解混勻后上樣
紋理(縱向條紋)	樣品中含有不溶性顆粒	樣品充分攪拌混勻
條帶偏斜	電極不平衡或者加樣位置偏斜	調整電極和加樣
條帶兩邊擴散	加樣量過多	適當減少上樣量
Marker 變黑色	抗體和 Marker 蛋白反應	在 Marker 和 sample 之間空出一個孔不上樣
背景高	膜封閉不夠	延長封閉時間，選擇適宜的抗體稀釋度
	一抗稀釋度不適宜	對抗體進行滴度測試，選擇適宜的抗體稀釋度
	一抗孵育的溫度偏高	建議 4℃ 結合過夜
	二抗濃度度過高	降低二抗濃度
	二抗的非特異性背景	增加一個二抗對照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否是由于二抗所致。可選擇其它二抗（特異性更強的，只針對重鏈）
	二抗孵育時間過久	減少二抗孵育時間
	選擇膜的問題	硝酸纖維素的背景會比 PVDF 膜低
	膜在實驗過程中干過	實驗過程中要注意保持膜的濕潤
	檢測時曝光時間過長	注意曝光時間的縮短
	洗膜不充分	增加洗膜的時間和次數
	抗體和封閉蛋白有交叉反應	檢測抗體與封閉蛋白的交叉反應性，選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入 Tween-20 可減少交叉反應
雜帶較多	目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點，糖基化位點，乙酰化位點等），本身可以呈現多條帶	查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白試劑大小
	目的蛋白有其他剪切本	查閱文獻或生物信息學分析可能性
	樣品處理過程中目的蛋白發生降解	裂解液中加入蛋白酶抑制劑，樣品處理在冰上進行
	上樣量過高，太敏感	適當減少上樣量
	一抗不純	純化抗體
	一抗特異性不高	重新選擇或制備高特異性的抗體
	二抗的非特異性結合	增加一個二抗對照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否是由于二抗所致。可選擇其它二抗（特異性更強的，只針對重鏈）
	一抗或二抗濃度偏高	降低抗體濃度
	細胞傳代較多，導致蛋白變異	使用原代或傳代少的細胞作對照
蛋白條帶位置（大小）不對	二聚體或多聚體存在	增加蛋白質變性過程及強度
	翻譯后剪切	比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的，在執行功能時需要進行剪切成活化的形式
	相對電荷	氨基酸電荷的組成
	蛋白修飾	比如糖基化、磷酸化等修飾狀態會導致蛋白分子量增加
	膠濃度	不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差
無蛋白條帶	抗體孵育不充分	增加抗體濃度，延長孵育時間
	酶失活	直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物
	標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低	設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因
	試劑之間不匹配	一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測系統的有效性
	一抗失效	選擇在有效期內抗體，幷選擇現配現用的工作液
	HRP 抑制劑	所用溶液和容器內避免含有疊D化鈉
	抗體不能識別測試種屬的相關蛋白	購買抗體前應認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白
	二抗與一抗不匹配	選擇針對一抗來源種屬的抗體
蛋白條帶信號弱	抗體孵育不充分	增加抗體濃度，延長孵育時間
	酶活性降低	直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物
	洗膜過度	洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用 0.1% 的弱去垢劑 Tween-20
	標本中靶蛋白含量太低	增加樣本上樣量
	抗體活性降低	選擇有效期內的抗體，工作液現配現用，避免長時間放置
	蛋白轉移不充分	可以用麗春紅染膜幷結合染膠（考馬斯藍）后確定條帶是否轉移到膜上或轉移過度，適當調整轉膜的時間和電流
	封閉過度	減少封閉劑的量或縮短時間，換用不同封閉劑類型
	曝光時間過短	延長曝光時間
	HRP 抑制劑	所用溶液和容器內避免含有疊D化鈉
背景有黑色斑點	抗體與封閉試劑反應	使用前過濾封閉試劑
背景有黑色斑點	HRP 偶聯二抗中有聚集體	過濾二抗試劑，去除聚集體
暗背景上白色帶	HRP 含量過高	降低酶聯二抗的濃度
背景有不均勻的白色斑點	轉膜過程中有氣泡存在	仔細檢測，避免存在氣泡
背景有不均勻的白色斑點	抗體分布不均勻	孵育抗體時使用搖床

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