ELISA實驗中對所使用的酶也有所要求，主要為純度高、催化反應的轉化率高、專一性強、性質穩定、來源豐富、價格便宜、制備成的酶標抗體或抗原性質穩定，與抗體或抗原偶聯后需繼續保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標本中不存在與標記酶相同的酶。此外，酶的底物應易于制備和保存，價格低廉，有色產物易于測定，光吸收度高。ELISA中常用的酶為辣根過氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP）。

HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18％，分子量為 44kD，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成的一種卟啉蛋白質。主酶為無色糖蛋白，在275nm 波長處有最高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環，在403nm 波長處有最高吸收峰。

HRP的純度用RZ（ReinheitZahl，意為純度數）表示，是403nm的吸光度與280nm的吸光度之比，高純度的 HRP的 RZ≥3.0。應注意的是酶變性后，RZ 可不變但活力降低，故選用酶制劑時更重要的指標為活力。酶活力以單位表示：1 min 將1μmol的底物轉化為產物的酶量為1個單位。HRP催化反應：DH2 + H2O2—— D +2H2O。

OPD是在ELISA中應用最多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點是配成應用液后穩定性差，而且有潛在的致癌作用，使用時應注意防護。而TMB無此缺點，TMB經酶作用后由無色變藍色，目測對比鮮明；加酸停止酶反應后變黃色，可在比色計中定量；因此應用日見增多。

ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。在ELISA中另一常用的酶為堿性磷酸酶。從大腸桿菌提取的AP分子量為 80kD，酶作用的最適pH為8.0；用小牛腸粘膜提取的AP分子量為100kD，最適pH為9.6。一般采用對硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。

產物為黃色的對硝基酚，在405nm 有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩定一段時間。在ELISA中應AP系統，其敏感性一般高 HRP系統，空白值也較低。但由于獲得高純度AP較難，穩定性較HRP低，價格較HRP高，且制備酶結合物時得率較HRP低等原因，在ELISA中一般較多采用HRP。

除HRP和AP以外，可應用于ELISA試劑中的酶還有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。如β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），經酶水解后產生熒光物質4-甲基傘酮（4-mehtylumbelliferone），可用熒光計檢測。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可使用可產生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點是需要熒光計測定，而且如用固相載體直接作為測定容器，此載體不可發出熒光。