聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。PCR實驗過程中問題詳解：
一、沒有ct值
檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:
1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);
2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。
二、ct值過晚
在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。
因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。
1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;
2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。
三、陰性對照擴增有信號
照擴增有信號排查各操作環節是否有不當,造成交叉污染:
1、引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現；
2、引物濃度不佳。適當降低引物濃度,并注意上下游引物的濃度配比；
3、鎂離子濃度過高。適當降低鎂離子濃度,或選擇更適合的mix試劑盒；
4、模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入,或通過引物設計避免非特異性擴增；
5、交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染, 或操作環境中有氣溶膠造成污染, 建議對操作環境進行處理, 或者更換新的環境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。
四、標準曲線不佳
標準曲線線性關系不佳R2<0.9,很有可能是以下環節存在問題:
1、標準品稀釋或者加樣誤差,使得標準品不呈梯度;
2、標準品出現降解。應避免標準品反復凍融,將高濃度DNA模板分裝,保存于-20℃或-80℃,現配現用;
3、引物或探針不佳。重新設計更好更穩定的引物或探針;
4、模板中存在抑制物。模板濃度過高,根據現有商品化熒光定量試劑盒的要求,一般模板量以50—500ng為宜。
五、熔解曲線峰不特異
熔解曲線峰不特異很有可能是以下環節存在問題:
1、引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現; 引物濃度不佳, 尤其是涉及二聚體存在時, 適當降低引物濃度, 并注意上下游引物的濃度比例;
2、模板有基因組污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入, 或通過引物設計避免非特異性擴增；
3、離子濃度不合適。適當降低鎂離子濃度, 或選擇更適合的mix試劑盒, 不同試劑盒在該方面的優化能力不適合, 有些情況下可以通過更換試劑盒改善結果。
六、擴增曲線異常
遇到擴增曲線異常,比如“S”型曲線等等情況,有可能是以下環節存在問題:
1、模板的濃度太高或者降解;
2、熒光染料的降解;
3、在操作熒光定量PCR時,帶上新的一次性手套,蓋上避免任何指紋或者字跡等;
4、液體揮發。耗材氣密性等問題引起液體蒸發,沒有很好的聚集在管子里;
5、氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。
七、擴增效率低
該情況適用于針對所有的基因,特別是內參基因仍無法獲得較好的擴增信號時,應考慮如下情況:
1、反應試劑中部分成分比例是否最佳,另外考慮熒光染料是否降解;
2、反應條件不夠優化。可適當降低退火溫度或改為三步擴增法,適當延長變性退火時間;
3、反應體系中有PCR反應抑制物。一般是加入模板時所引入的,應先把模板適度稀釋,再加入反應體系,減少抑制物的影響。
