貨號 | 名稱 | 規格 |
SH0090 | 檸檬酸合酶(CS)檢測試劑盒(分光光度50T/24S) | 50T/24S |
SH0091 | 檸檬酸合酶(CS)檢測試劑盒(分光光度25T/12S) | 25T/12S |
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義:
CS(EC 2.3.3.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體基質中,是三羧酸循環第一個限速酶,是三羧酸循環主要調控位點之一。
測定原理:
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產生檸檬酰fumei a,進一步水解產生檸檬酸;該反應促使無色的DTNB轉變成黃色的TNB,在 412nm處有特征吸光值。
組成:
產品名稱 | SH0091-25T/12S | SH0090-50T/24S | Storage |
試劑一:液體 | 25ml | 50ml | -20℃ |
試劑二:液體 | 5ml | 10ml | -20℃ |
試劑三:液體 | 0.5ml | 1ml | -20℃ |
試劑四:液體 | 28ml | 55ml | 4℃ |
試劑五:粉劑 | 1瓶 | 1瓶 | 4℃ |
試劑六:粉劑 | 1支 | 1支 | -20℃ |
說明書 | 一份 |
SH0091-25T/12S試劑六:粉劑×1支,-20℃保存,臨用前加入1.2ml蒸餾水,用不完的試劑仍-20℃保存;
SH0090-50T/24S試劑六:粉劑×1支,-20℃保存,臨用前加入2.4ml蒸餾水,用不完的試劑仍-20℃保存;
自備儀器和用品:
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1ml玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水
樣本的前處理:
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
① 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1ml試劑一和10μl 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿600g,4℃離心5min。
③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
④ 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的CS(此步可選做)。
⑤ 在步驟④的沉淀中加入200μl試劑二和2μl 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于線粒體CS測定。
測定步驟:
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至412nm,蒸餾水調零。
2、樣本測定
(1)在試劑五中加入0.6ml無水乙醇和13ml試劑四,混勻,37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
(2)測定管:在EP管中加入40μl樣本、880μl試劑五和40μl試劑六,混勻,37℃反應15min后立即測定吸光值A1。
(3)對照管:在EP管中加入40μl樣本、880μl試劑四和40μl試劑六,混勻,37℃反應15min后立即測定吸光值A2。
(4)計算ΔA=A1-A2,每個測定管設一個對照管。
CS活性計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=23.8×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
CS(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.0475×ΔA
V反總:反應體系總體積,9.6×10-4 L;ε:TNB摩爾消光系數,1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.04 ml;V樣總:加入提取液體積,0.202 ml;T:反應時間,15 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/ml;W:樣本質量,g;500:細胞或細菌總數,500萬。