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LbCas12a (又名 Cpf1)核酸酶來源于 Lachnospiraceae bacterium ND2006 菌株。LbCas12a 是由 crRNA 介導的 DNA 核酸內切酶，在靶標雙鏈 DNA 存在 PAM (TTN) 序列的情況下，特異地剪切靶標雙鏈 DNA，使 DNA 雙鏈斷裂并生成粘性末端。而 LbCas12a 特異地剪切單鏈 DNA 靶標不依賴 PAM 序列。此外，雙鏈或單鏈 DNA 靶標均能激活 LbCas12a 的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當 LbCas12a酶與 crRNA、靶標 DNA 結合形成三元復合物后，便會被激活針對非特異序列 ssDNA 的反式剪切活性，將體系中的任意序列 ssDNA 切碎。因此，LbCas12a 酶不僅可用于體外 dsDNA 的特異剪切，也可用于靶標核酸的快速檢測，詳見本公司開發的 HOLMES[1]核酸快檢技術。
產品組分
組分 | 32108-01(100 pmol) | 32108-03(1000 pmol) |
LbCas12a Nuclease (10 μM)a
| 100 pmol | 1000 pmol |
10 × HOLMES Buffer 1 | 1 mL | 1 mL |
Control Target DNA and crRNA b | 5 μL | 5 μL |
a. LbCas12a Nuclease 濃度為 10 μM，即 10 pmol/μL，100 pmol 規格的總體積為 10 μL，1,000 pmol 規格的總體積為 100 μL；
b. Control Target DNA and crRNA 應保存于-80℃并避免反復凍融，必須在 6 個月內使用，使用時建議取 0.5 μL 至每 20 μL 反應體系。
保存條件
Control Target DNA and crRNA 于-80℃儲存，其余組分-20℃儲存；≤ 0℃運輸。
活性定義
在總體積為 20 μL 的 1 × HOLMES Buffer 1 [pH 8.5]反應體系中，37℃反應條件下，1 min 內剪切 1 pmol
ssDNA 探針所需的 Cas12a 酶量定義為 1 transU[2]。
例：若某批次 LbCas12a 酶的反式切割活性為 50.0 transU/pmol，則表明 1 pmol 的該批次 LbCas12a 酶可在 1 min 內，在上述zhiding的反應條件下，反式切割 50 pmol ssDNA 探針。本公司提供的 Cas 酶 transU 數值詳見各批號的 COA 檢測報告。
實驗流程
1、順式剪切實驗
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM LbCas12a Nuclease | 0.5 μL | 250 nM |
10 μM crRNA | 0.5 μL | 250 nM |
1 μM Target DNA c | 0.5 μL | 25 nM |
Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
c. 順式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。
l若用核酸電泳來分析順式剪切產物，建議使用 dsDNA靶標，因為 ssDNA靶標會被反式激活的 Cas12a 進一步切碎。對于 20 μL 順式剪切應體系，推薦 target DNA的使用量為 100 ng～500 ng，且 target DNA片段長度在 300 bp～3 kb 范圍內。不同長度 target DNA需要的 Cas 酶和 crRNA的量需要根據 target DNA的摩爾量計算，建議保持 Cas 酶:crRNA:target DNA的摩爾比為 10:10:1，以盡量確保 targetDNA被剪切wanquan。
37℃反應 30 min~1 h，85℃滅活 5 min，核酸電泳分析順式剪切產物。
2. 反式剪切實驗
組分 | 體積 | 終濃度 |
10 × HOLMES Buffer 1 | 2 μL | 1 × |
10 μM LbCas12a Nuclease | 0.05~0.5 μL | 250 nM |
10 μM crRNA | 0.05~0.5 μL | 250 nM |
1 μM Target DNA d | 0.5~5 μL | 250 nM |
10 μM ssDNA Reporter | 0.05~0.5 μL | 250 nM |
Nuclease-free Water | Up to 20 μL |
d. 反式剪切體系中 Target DNA 可為 ssDNA 或帶 PAM 序列的 dsDNA。
*反式剪切體系中各組分的用量可以根據不同的實驗目的進行調整，用量較少時可先將各組分稀釋后加入體系，LbCas12a Nuclease 可用 1×HOLMES Buf er 1 稀釋，稀釋后需立即使用（若要稀釋后的 Cas12 酶長期保存，請使用 Cas12 Dilution Buf er，#32012），crRNA、Target DNA 及 ssDNA Reporter 可用 Nuclease-free Water 稀釋，但極低濃度的 Target DNA（例如 LOD 實驗）建議用 0.1% Tween 20 稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。
*反式剪切體系中探針的用量和預期反應到達平臺期的時間可參考各批號Cas 酶transU的具體數值，詳見本公司提供的 COA檢測報告！
實時熒光定量 PCR 儀檢測熒光信號，37℃反應，每 30 sec 采集一次熒光信號。
實驗結果
注意事項
1. 不同來源的 Cas12a 酶，其識別靶標所需的 PAM 位點也略有不同，其中大部分 Cas12a 酶可識別 TTN位點，而部分 Cas12a 則識別 TTTN 位點。
2. Cas12a 的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12a 在 crRNA 的引導下，特異性地剪切 target DNA。dsDNA 靶標需帶有 PAM 位點，而 ssDNA 靶標不依賴 PAM 位點。
3. Cas12a 的反式剪切(trans-cleavage)：當 target DNA 存在時，Cas12a/crRNA 與 target DNA 形成三元復合物(Cas12a/crRNA/target DNA)，同時，Cas12a 被激發反式剪切活性，將反應體系中任意序列的單鏈 DNA
切碎。
4. 利用本產品的反式剪切活性進行分子診斷實驗，可參考本公司的 HOLMES 體系[1]。
