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產(chǎn)品及特點(diǎn)

牛細(xì)小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒是一種傳染性腸炎病毒，會(huì)引起牛之間的傳染病，以高熱、嘔吐、白細(xì)胞嚴(yán)重減少和腸炎為特征，感染病毒后，病牛會(huì)迅速脫水，消瘦，眼窩深陷，被毛凌亂，皮膚無(wú)彈性，耳鼻，四肢發(fā)涼，精神高度沉郁，休克， 死亡。從病初癥狀輕微到嚴(yán)重一般不超過(guò) 2 天，整個(gè)病程一般不超過(guò)一周，發(fā)病迅速， 傳播范圍廣，因此牛細(xì)小病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開(kāi)發(fā)了簡(jiǎn)單快捷的牛細(xì)小病毒染料法熒光定量 PCR 檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開(kāi)即用，用戶(hù)只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)牛細(xì)小病毒保守序列設(shè)計(jì)的專(zhuān)一性引物，與相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測(cè)，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

規(guī)格及成分

成分

編號(hào)

十孔盒包裝

2×qPCR MagicMix

90408

500 μL（棕色管）

熒光PCR 模板稀釋液

180701

1 mL（黃蓋）

牛細(xì)小病毒染料法PCR 引物混合物

14-44000yw

100 μL（白蓋）

牛細(xì)小病毒染料法PCR 陽(yáng)性對(duì)照

(1×10E8  拷貝/μL)

14-44000pc

50 μL（紅蓋）

天凈沙核酸釋放劑（試用裝）

61202

20 次（1mL，綠蓋）

使用手冊(cè)

14-44000sc

1 份

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見(jiàn)使用方法）。

使用方法

一、稀釋 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

1. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
2. 在  7  號(hào)管中加入  5  μL  1×10E8  拷貝/μL  的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩  1  分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

1. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5  μL  1×10E7 拷貝/μL  的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
2. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5  μL  1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
3. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
4. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照）， 一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 上步制備的 PCR 陽(yáng)性對(duì)照的第 4號(hào)（濃度為 1×10E4  拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝）或第 5 號(hào)（濃度為 1×10E5拷貝/μL，10μL  相當(dāng)于  10  萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
5. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA  提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 20 次天凈沙核酸釋放劑，其使用手冊(cè)可從本公司網(wǎng)站通過(guò)搜索產(chǎn)品名稱(chēng)天凈沙核酸釋放劑或產(chǎn)品編號(hào) 61202 下載。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

1. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè)PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè)PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
2. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢

后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：

成分

樣品管

N+2 個(gè)

PCR 陰性

對(duì)照管

PCR 陽(yáng)性

對(duì)照管（2-7 管）

2×qPCR MagicMix

10 μL

10 μL

各 10 μL

牛細(xì)小病毒染料法PCR

引物混合液

2 μL

2 μL

各 2 μL

自備 10×ROX (見(jiàn)注)

2 μL

2 μL

各 2 μL

N+2 待測(cè)樣品 DNA 模板

6 μL

不加

不加

超純水

不加

6 μL

不加

第 7 步所得 PCR 陽(yáng)性對(duì)照

不加

不加

各 6μL（2 號(hào)樣到

稀釋液（2-7 號(hào)）

2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3

號(hào)管…）

注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用ROX 作為對(duì)照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。

1. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

四、數(shù)據(jù)處理

1. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上推算出樣品 DNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。
2. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線(xiàn)，Ct  值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則

為陰性，如果小于 40，則為陽(yáng)性。

關(guān)聯(lián)產(chǎn)品

牛細(xì)小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒