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上海博湖生物科技有限公司
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人血管緊張素Ⅱ受體抗體elisa試劑盒實驗前準備和操作步驟以及注意事項
2018-11-22 閱讀(353)
| 提 供 商 | 上海博湖生物科技有限公司 | 資料大小 | 20KB |
|---|---|---|---|
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| 資料類型 | WORD 文檔 | 瀏覽次數 | 353次 |
試劑準備
1.使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫 （18-25℃），試劑不能直接在 37℃ 溶解。
2.標準品 （凍干品）：每瓶標準品加入標準品稀釋液 1 mL，蓋好后室溫靜置大約 10 分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為 1000pg/mL。準備 7 個稀釋標準品的 EP 管，每個 EP 管中加入 500μL 的標準品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成 1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6pg/mL，標準品稀釋液 （0pg/mL） 直接作為空白孔。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
3.檢測溶液 A 及檢測溶液 B：Detection A 及 Detection B 在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液 A 或 B1:100 稀釋 （如：10μL 檢測溶液 A/990μL 檢測稀釋液 A），充分混勻，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制 （100μL/孔），實際配制時應多配制 0.1-0.2 mL。
4.濃洗滌液：用 580 mL 蒸餾水或去離子水將 20 mL 濃洗滌液稀釋至 600 mL，進行 30 倍稀釋。
5.底物溶液：請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的 TMB 至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應予丟棄，不要倒回 TMB 瓶中。
注意：
1、 標準品的稀釋不能直接在板中進行。
2、 標準品請于臨用前 15 分鐘內配制。該標準品只能使用一次。
3、 標準品、檢測溶液 A 工作液、檢測溶液 B 工作液請使用相應的稀釋液配制，不能混淆。混勻時要輕輕充分混勻，避免起泡。為保證實驗結果的準確請使用微量吸管，并校準微量加液器。請依據所需的量配制，盡量不要微量配制 （如吸取檢測溶液 A 時，一次不要小于 10μL），以避免造成濃度誤差。
4、 請勿重復使用已經稀釋過的標準品、檢測溶液 A 工作液和檢測溶液 B 工作液。
5、 濃洗滌液中如有結晶析出，請先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結晶*溶解再進行配制。
6、 試劑盒中部分試劑為儲存液，客戶需配置成工作液后使用，在配置過程中如因純凈水質量差或水質污染，以及實驗中所用耗材潔凈度差，可能造成實驗結果不準
操作步驟
1.加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔 7 孔，依次加入 100μL 不同濃度的標準品 （見試劑準備 2）。空白孔加 100μL（見試劑準備第二步*后一管），余孔加待測樣品 100μL，酶標板加上覆膜，37℃ 溫育 2 小時。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。
3.每孔加檢測溶液 A 工作液 100μL（臨用前配制），酶標板加上覆膜，37℃ 溫育 1 小時。
4.棄去孔內液體，每孔用 300μL 的洗滌液洗滌，浸泡 1-2 分鐘，吸去 （不可觸及板壁） 或甩掉酶標板內的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次 （也可輕拍將孔內液體拍干），重復洗板 3 次。*后一次洗滌后，要把孔內的洗滌液*甩干。自動洗板機亦可。
5.每孔加檢測溶液 B 工作液 （臨用前配制）100μL，加上覆膜，37℃ 溫育 1 小時。
6.棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 4。
7.每孔加底物溶液 90μL，酶標板加上覆膜，37℃ 避光顯色 （反應時間控制在 15-25 分鐘，不要超過 30 分鐘。當標準孔的前 3-4 孔有明顯的梯度藍色，后 3-4 孔梯度不明顯時，即可終止）。
8.每孔加終止溶液 50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。
9.在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度 （O.D. 值）。
注意：
1.試劑準備：準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。
2.加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，個孔與*后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的「預溫育」時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。因此，一次加樣時間 （包括標準品及所有樣品） 控制在 10 分鐘內。設置復孔進行實驗。
3.溫育：為防止樣品蒸發，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4.洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液*甩干。洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響*后的酶標儀讀數。如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實 驗過程中。
5.反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化 （比如，每隔 10 分鐘觀察一次），如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。
6.底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7.如果實驗室內濕度低于 60%，使用加濕器提高濕度水平。
