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運輸：低溫
保存：-20℃避光

有效期：一年

貨期：2-3周

產品用途：公司產品僅供科研研究實驗

試劑組成:

特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品。

2. 根據保守序列設計的專一性引物。

3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。

4. 一管式熒光定量PCR檢測，避免后續污染。

5. 本試劑盒足夠50次20μL反應體系的熒光定量PCR。

本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

注意事項:

1、所有步驟均應在超凈工作臺上進行，超凈臺紫外照射至少15min。

2、所有試劑應為此實驗專用。

3、使用75％乙醇或其他去污劑擦拭工作臺，避免表面污染。

4、進入熒光定量PCR 操作實驗室后需要佩戴一次性無菌口罩、無菌乳膠手套、實驗中盡量避免與同事交談，防止PCR 模板污染。

5、實驗中使用各種規格的離心管，槍頭及配制試劑和溶解沉淀用的水，均應焦碳酸二乙酯（DEPC）處理后使用，以去除吸附的RNA酶污染。

6、使用Trizol試劑時，避免接觸皮膚或衣服。避免吸入蒸氣。

7、qPCR反應需要qPCR級水，試劑和試管。請務必使用正確類型的qPCR光學PCR管和蓋子。不可用普通的PCR管。

8、加樣前，先布局，規劃加樣順序以避免交叉污染。

9、所有實驗應均應設置無模板對照，其中包含除DNA或cDNA樣品以外的所有反應組分。

10、先配制qPCR反應混合液，減少誤差。

11、加樣后上機前，務必通過瞬離將反應液離至管底，并消除溶液中的氣泡，因為氣泡會干擾熒光檢測且降低酶活性，從而降低擴增效率。

操作流程：

RNA 提取 → 反轉錄 → 設計引物 → Q-PCR

一、 總RNA提取

A組織樣本：迅速將新鮮的組織切成合適的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1ml Trizol。

B全血樣品：加入3-5倍體積的紅細胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min，室溫3500rpm離心6min。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mL Trizol。

C細胞樣品：懸浮液中生長的細胞，通過離心收集細胞后，每1×105?106細胞加入1mL Trizol，移液器吹打混勻，直接裂解或-80℃儲存一個月。貼壁生長的細胞，有兩種處理方法。一種是移除培養基后，將1mL Trizol直接加入直徑3.5cm的培養皿中裂解細胞。或是先用將貼壁細胞消化下來并收集后，再加入1mL Trizol進行裂解。（Note：加入Trizol前, PBS充分洗滌細胞去除殘余培養基。）

二、直接法

1）加入1ml Trizol試劑，混勻，冰上孵育10min。

2）4℃，12000rpm離心10min，小心轉移上清液到不含顆粒的新EP管中。

3）加入200ul氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育5min。

4）4℃，12000rpm離心15min。混合液分三層，包括最下面的氯仿有機相，中間相和上層水相。小心轉移上層水相到新的EP管（大約60％體積的Trizol），不要吸取中間相，可留下少量上層液體！（Note：質量比數量更重要！）

5）加入等體積的異丙醇，輕輕地顛倒混勻約10次，室溫放置10min。

6）4℃，12000rpm離心10min。棄上清，1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次。

7）4℃，12000rpm離心5min，棄上清，室溫下風干5-10min（不要太干，過度干燥會導致RNA難溶解！）。將RNA溶于15μl-50μlDEPC水中。

8）立即進行反轉錄反應，或先-80℃長期保存。

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