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上海莼試生物技術有限公司

甲醛變性電泳的原理和實驗程序

時間:2017-5-18閱讀:382
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進口檢測試劑盒用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結果可用于判定核酸的純度。由于DNA分子較RNA分子大許多,電泳遷移率低;而RNA中以rRNAzui多,占到80%~85%,tRNA及核內小分子RNA占15%~20%,mRNA占1%~5%。故總RNA電泳后可呈現特征性的三條帶。在原核生物為明顯可見的23S、16S的rRNA條帶及由5S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA構成的條帶。mRNA因量少且分子大小不一,一般是看不見的。故可通過分析以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結果。

1. 甲醛變性的瓊脂糖(Agarose) 凝膠的配制

進口檢測試劑盒在250 mL的錐形瓶中準確稱量2 g Agarose (Sigama),再加20 mL 10×TAE Buffer,144 mLDEPC處理過的雙蒸水,微波爐中化膠,待冷卻至50-60℃加EB至終濃度≤0.5 μg/mL。在通風櫥中加入36 mL甲醛,放置一段時間以減少甲醛蒸汽。

2. RNA的甲醛變性電泳

(1) 樣品制備

RNA總量:10 μg

5×甲醛凝膠電泳緩沖液:4 μl

甲醛: 3.5 μl

甲酰胺:10 μl

加入無菌離心管中混合,95℃水浴變性2 min(或55℃,15 min),取出后放入冰中冷卻。

(2) 加入2 μl無菌的DEPC處理的加樣運載液。(使用加樣運載液的目的有三: 增大樣品密度,以確保DNA均勻進入樣品孔內;使樣品呈現顏色,便于加樣操作;能明確顯現樣品在電泳膠上的泳動位置。以 0.5 X TBE作電泳液時,溴*在瓊脂糖中的泳動速率與長 300 bp 的雙鏈線狀DNA相同,而二甲苯氰FF 的泳動速率與長4 kb 的雙鏈線狀DNA相同。)

(3)進口檢測試劑盒將膠板浸沒在1×甲醛凝膠電泳緩沖液中,點樣前5 V/cm預跑5 min。點樣后3-4 V/cm電泳。

(4)電泳結束后(溴*藍遷移到約8 cm處),紫外燈下觀察, 照相。

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