7-AAD Cell Cycle Analysis Kit細胞周期檢測試劑盒

產品信息

產品描述

7-AAD 細胞周期檢測試劑盒（7-AAD Cell Cycle Analysis Kit）是一款采用7-AAD染色法進行細胞周期檢測的試劑盒，通過流式細胞儀進行分析。本試劑盒通常用于貼壁細胞或懸浮細胞的細胞周期檢測。對于組織樣品，需經消化成單細胞后才可用此試劑盒進行檢測。

7-氨基放線jun素D（7-Aminoactinomycin D,7-AAD）是一種不具有膜滲透性的DNA結合染料（選擇性插入DNA的GC富集區），通常被活細胞排除在外?；罴毎驮缙诘蛲黾毎懦?-AAD不被染色，但具損傷質膜或受損/無代謝活動的細胞無法阻擋染料進入而被染色。7-AAD/DNA復合物能被488nm的氬離子激發器，發生大的斯托克斯遷移，發射波長在647nm。細胞經7-AAD染色后，假設G0/G1期細胞的熒光強度為1，那么，含雙份基因組DNA的G2/M期細胞的熒光強度理論值為2，正在進行DNA復制的S期細胞的熒光強度介于1-2（見附圖I）。

產品組成

保存與運輸方法

保存：染色緩沖液+4℃保存，7-AAD染色液+4℃避光保存，RNase A-20℃保存，一年有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） 因7-AAD也能結合RNA，因此，試劑盒內提供RNase A用來降解RNA，以降低背景熒光。然而，雖有資料顯示，7-AAD不和RNA結合，但從我司的實驗數據來看，添加RNase處理的效果更好。

2） 因7-AAD不具有細胞膜滲透性，則需先對細胞進行乙醇固定，再進行后續染色。

3） 請自行準備95%乙醇和PBS。

4） 熒光染料均存在熒光淬滅，保存和使用過程中請注意避光，以減緩淬滅。

5） 因7-AAD對人體有刺激性，請注意適當防護。

6） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、 染色步驟

1.1 細胞樣品的準備：每個樣品的細胞數量可以為500萬以上。

a）對于貼壁細胞：小心收集細胞培養液到一干凈離心管內備用。用胰mei消化細胞，直至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。1000rpm離心3-5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果無法完quan離心至管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心速度。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養液，以避免吸走細胞。加入約1ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。再次加入1ml冰浴預冷的PBS，重懸細胞。

b）對于懸浮細胞：1000rpm離心5min沉淀細胞。對于特定的細胞，如果無法完quan離心至管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心速度。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養液，以避免吸走細胞。加入1ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞，并轉移到1.5ml離心管內。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的PBS，以避免吸走細胞。再次加入1ml冰浴預冷的PBS，重懸細胞。

c）對于組織樣本：用剪刀將組織剪成盡量小的小塊后，用0.25%胰mei消化30-60min（或根據實際情況選擇適當的混合酶來進行組織消化），經過200-400目細胞篩網過濾得到單細胞懸液。然后參照步驟b）對于懸浮細胞來準備樣品。

1.2 細胞固定：取4ml冰浴預冷的95%乙醇，一邊低速渦旋震蕩的同時逐滴加入1ml細胞懸液（冰上操作），混勻后于4℃固定2h或更長時間，固定12~24h可能效果更佳。1500rpm離心5min沉淀細胞。對于特定的細胞，如果無法完quan離心至管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心速度。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的乙醇固定液，以避免吸走細胞。加入約5ml冰浴預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的PBS，以避免吸走細胞。輕輕彈動離心管底以分散細胞避免細胞成團。

1.3 7-AAD染色工作液的配制：參照下表根據實際檢測樣本的數量配制足量的7-AAD染色工作液【注意：7-AAD染色工作液短時間可4℃保存，但需當日使用】。

1.4 染色：每管細胞樣品中加入0.1ml 7-AAD染色工作液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37℃避光孵育30min。隨后可置于4℃或冰浴避光存放。

1.5 加入2ml PBS，1500rpm離心5min，去上清。

1.6 加入500μl PBS，流式細胞儀上機檢測?！菊堅?4h內完成流式檢測，能在當天完成流式檢測?！?/p>

1.7 流式檢測與分析：用流式細胞儀在激發波長488nm處檢測紅色熒光（7-AAD通道或PerCP通道），同時檢測光散射情況。采用適當分析軟件進行DNA含量和光散射分析。

【注意】：j上機時，熒光通道設置為線性放大（Linear Scale）；k數據分析，去除粘連細胞。

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附圖I.典型的7-AAD細胞周期示例圖（參考用）

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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