磷酸鈣轉(zhuǎn)染法的原理是通過(guò)DNA，氯化鈣與磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA的極小不溶解的磷酸鈣顆粒。這些磷酸鈣顆粒會(huì)粘結(jié)到細(xì)胞膜上通過(guò)胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞中，從而達(dá)到外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的目的。磷酸鈣轉(zhuǎn)染法主要用于慢病毒包裝。由于慢病毒包裝需要的質(zhì)粒量大，脂質(zhì)體用量大，可能會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)。而磷酸鈣沉淀法因?yàn)樵噭┮兹〉?、價(jià)格便宜而被廣泛應(yīng)用。

磷酸鈣轉(zhuǎn)染法實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1. 轉(zhuǎn)染前24小時(shí)選擇狀態(tài)良好的293T細(xì)胞傳代， 4×10^6個(gè)細(xì)胞接種于10cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

2. 20-24h后，待細(xì)胞長(zhǎng)至鋪滿(mǎn)細(xì)胞皿底約40-50%的時(shí)候，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

A：取1.5mlEP管，加入質(zhì)粒：

Lentivirus vector： 10ug

VSVG 質(zhì)粒 5ug

REV 質(zhì)粒 5ug

選擇超純水補(bǔ)至100ul。

向上述DNA溶液中加入50ul 2 M CaCl2 溶液，輕輕吹吸混勻。

B．向上述液體中逐滴加入2XHBS，立即吹打混勻在至呈現(xiàn)乳白色?；蛘哌x用電動(dòng)移液槍?zhuān)贿叺渭?，一邊用電?dòng)移液槍進(jìn)行吹打。不要超過(guò)一分鐘。

C．將制備的混懸液室溫放置10-15分鐘。

D．將制備的混懸液輕輕地均勻滴入培養(yǎng)皿，輕輕搖勻后置于培養(yǎng)箱中，6-8h后換液。

因?yàn)樵诖荡蚧靹蛞后w過(guò)程中，每個(gè)人的吹打力度不同，因此在制備混合液后可以取載玻片置于顯微鏡下，滴加一滴混合液，觀察些顆粒大小。以便摸索實(shí)驗(yàn)的合適條件。

3、轉(zhuǎn)染12至16小時(shí)之后給293T細(xì)胞換液。

4、轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后，如果質(zhì)粒帶有熒光標(biāo)簽，可以通過(guò)觀察熒光判斷轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)收集293T細(xì)胞的培養(yǎng)基, 3000rpm離心10分鐘去除細(xì)胞碎片。

5、將離心后上清進(jìn)行分裝，如果一周內(nèi)使用，可以臨時(shí)放于4度冰箱。將其他分裝的上清凍存于－80度冰箱中。因?yàn)椴《旧锨宸磸?fù)凍融，會(huì)造成病毒的滴度明顯下降。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑配制

一.2XHBS（100ml）：

NaCl: 1.636g,終濃度280mM

KCl:0.074g, 終濃度10mM

Na2HPO4: 0.0537g, 終濃度1.5 mM

Glucose：0.2g, 終濃度12 mM

HEPES：1.19g, 終濃度50 mM

調(diào)節(jié)pH范圍在7.00- 7.45過(guò)濾分裝后進(jìn)行滅菌。

二.2M CaCl2(100ml)：

稱(chēng)取29.4g CaCl2-H2O，加入超純水，過(guò)濾分裝后進(jìn)行滅菌。