Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400,000，當密度為1.2g/ml仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。

工具/原料
全血 （以10ml為例）
無菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理鹽水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培養基 （Invitrogen）
胎牛血清（FBS）（GIBCO）
雙抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亞砜（DMSO）（SIGMA）
預先裝好異丙醇的凍存盒
方法/步驟
配制所需的溶液：

a. 細胞培養基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；

b. 細胞凍存液：FBS中加入10%DMSO；

將10ml全血轉入50ml離心管中，加入10ml PBS溶液稀釋，輕輕混勻；

取兩支15ml離心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后將稀釋的血液輕輕加到兩支離心管的ficoll上層，一定要輕柔，避免兩種溶液混合在一起，每只離心管各10ml稀釋血液；

2,000rpm，20min，注意，降速設置中一定要設置成no break，或者只有1-2成的制動。離心完畢將得到如圖所示分層；

人外周血單核細胞（PBMC）分離及培養
PBMC所在細胞層為白色。此時可以用吸管將該層細胞吸取在另一干凈的15ml離心管中。

加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min離心后去掉上清，再加入培養基進行相同操作的清洗；

7
加入5-10ml培養基重懸細胞，進行后續計數培養或者鋪板；

8
細胞凍存：將細胞離心收集之后，用細胞凍存液重懸。取1-1.5ml細胞至凍存管中，放入凍存盒（凍存盒可事先在4℃冰箱預冷）。再將凍存盒放置于-80℃冰箱過夜。第二天將細胞轉入液氮中保存。

END
注意事項
全血溶液可以加在Ficoll上層或者下層，但是終都必須保證兩種溶液分層清晰。
分離PBMC*步離心的時候，一定不能設置或設置低水平的制動。否則將分層混亂。