氧是生命運(yùn)動(dòng)過(guò)程中*的一種氣體, 人們一旦處于缺氧或者供氧不足的環(huán)境中, 就會(huì)感到憋氣的痛苦甚至死亡。所以, 自從1770 年代初英國(guó)人Joseph Priestley 發(fā)現(xiàn)氧以來(lái), 氧一直被人們認(rèn)為是一種對(duì)人體百益而無(wú)一害的氣體。可是, 科學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展起來(lái)的今天, 我們知道, 不管是空氣中的氧還是水中的溶解氧都具有較高的氧化性, 與一般的金屬鐵一樣, 處于空氣中的人體各部位都在不斷地受到氧的腐蝕而“生銹” , 當(dāng)然這種腐蝕與鐵不同, 它體現(xiàn)在人體的細(xì)胞水平上。特別是人體各種器官隨著年齡的增大不斷地老化更是這種腐蝕“生銹”的直觀表現(xiàn)。1969 年McCord 與Fridovich 發(fā)現(xiàn), 在生化反應(yīng)過(guò)程中O2 獲得一個(gè)電子還原生成超氧自由基(O-2 ), 進(jìn)而經(jīng)過(guò)紅血球的分離精制后獲得O-2 的清除滅活酶, 并命名為超氧化物歧化酶(superoxide dismultase , SOD)。這一發(fā)現(xiàn)激發(fā)了大批的科學(xué)研究者致力于O-2 的生成過(guò)程、反應(yīng)活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究, 去探索解明SOD 在生理學(xué)上的意義。同時(shí)由O-2 衍生出來(lái)的過(guò)氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)、激發(fā)態(tài)氧(一重態(tài)氧或稱(chēng)單線態(tài)氧,O2)也受到了人們的重視。
所謂的活性氧, 概括地說(shuō), 是指機(jī)體內(nèi)或者自然環(huán)境中由氧組成, 含氧并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱(chēng):主要有一種激發(fā)態(tài)的氧分子, 即一重態(tài)氧分子或稱(chēng)單線態(tài)氧分子(O2);3 種含氧的自由基, 即超氧陰離子自由基(O-2 )、羥自由基(·OH)和氫過(guò)氧自由基(HO2);2 種過(guò)氧化物, 即過(guò)氧化氫(H2O2)和過(guò)氧化脂質(zhì)(ROOH)以及一種含氮的氧化物(NO)等。這些物質(zhì)化學(xué)反應(yīng)活性強(qiáng)、存在壽命短, 如O2 的平均壽命為2μs 、·OH 自由基200 μs 、O-2 自由基5 s 。正是由于它們壽命短、反應(yīng)活性高, 到目前為止除了H2O2 以外,其它活性氧的測(cè)定仍然是一項(xiàng)性難題, 還沒(méi)有特別專(zhuān)一有效的方法。一般情況下采用的分析方法可大體有化學(xué)反應(yīng)法 、捕捉法和直接測(cè)定法。 [2] 
來(lái)源編輯
正常代謝
體內(nèi)正常代謝可以產(chǎn)生活性氧。線粒體是活性氧的一個(gè)重要來(lái)源，活性氧族如超氧陰離子自由基（O2-·）、過(guò)氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH·）和單線態(tài)氧都是有氧代謝的副產(chǎn)物。在大多數(shù)細(xì)胞中超過(guò)90%的氧是在線粒體中消耗的，其中2%的氧在線粒體內(nèi)膜和基質(zhì)中被轉(zhuǎn)變成為氧自由基。 [3] 
體內(nèi)的活性氧并不總是有害的，它對(duì)機(jī)體也有有利的一面。例如，機(jī)體內(nèi)吞噬細(xì)胞在細(xì)胞膜受到刺激時(shí)，通過(guò)呼吸暴發(fā)機(jī)制，產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 是吞噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬和殺傷作用的主要介質(zhì)。但是在病理?xiàng)l件下，由于活性氧的產(chǎn)生和清除失去了正常平衡，常常會(huì)造成活性氧對(duì)人體的損傷。 [3] 
輻射
人們很早就認(rèn)識(shí)到輻射可以在體內(nèi)產(chǎn)生活性氧。人體內(nèi)的水約占體重的60%，放射線初的作用就是使水輻射分解，產(chǎn)生H·OH·等，破壞細(xì)胞中的核酸、蛋白質(zhì)等大分子，終導(dǎo)致輻射病。T.Herrling 等人通過(guò)電子自旋共振（electron spin resonance，ESR） 的方法發(fā)現(xiàn)， 體外實(shí)驗(yàn)的皮膚細(xì)胞在紫外線的作用下可以產(chǎn)生氧自由基，并且這種輻射的效果與輻射強(qiáng)度和射線對(duì)皮膚的穿透作用的大小有關(guān)。 [3] 
化學(xué)因素
許多化學(xué)藥物如抗癌劑、抗生素、殺蟲(chóng)劑、麻醉劑、芳香烴類(lèi)等都可以誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧。高壓氧也可以誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生。M.Chavko 和A.L.Harabin 對(duì)在5 個(gè)大氣壓下飼養(yǎng)的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以檢測(cè)到脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的過(guò)氧化，同時(shí)還原型谷胱甘肽有下降的趨勢(shì)，表明有氧化損傷的存在。另外，過(guò)渡金屬離子對(duì)活性氧的形成很重要，這些離子去除電子的能力是形成和擴(kuò)展許多毒性極大的活性氧反應(yīng)的基礎(chǔ)。典型的例子就是鐵催化的Fenton 型反應(yīng)，即毒性較低的過(guò)氧化氫在過(guò)渡金屬鐵存在的情況下，生成活性*的羥自由基，從而產(chǎn)生更大的毒害作用。 [3] 
氧化損傷編輯
對(duì)核酸的氧化損傷
DNA 的氧化損傷主要包括：一是堿基的修飾。羥基自由基可對(duì)胸腺嘧啶的5，6-雙鍵進(jìn)行加成，形成胸腺嘧啶自由基。堿基的改變可導(dǎo)致其基團(tuán)控制下的許多生化與蛋白合成過(guò)程受到破壞。二是鍵的斷裂。自由基從DNA 的戊糖奪取了氫原子，使之在C4位置形成具有未配對(duì)電子的自由基，然后，此自由基又在β-位置發(fā)生鏈的斷裂。O2也能分解核苷酸，尤其是鳥(niǎo)苷酸，對(duì)鳥(niǎo)苷、腺苷、胞苷及尿苷分解的比例為26∶13∶8∶1。受到氧化損傷后的DNA 可能會(huì)發(fā)生斷裂、突變以及對(duì)熱穩(wěn)定性改變等，從而嚴(yán)重影響了遺傳信息的正常轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程。 [3] 
對(duì)蛋白質(zhì)的氧化損傷
活性氧對(duì)蛋白質(zhì)的作用包括修飾氨基酸，使肽鏈斷裂，形成蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚合物，改變構(gòu)像和免疫原性等5 個(gè)方面。
修飾氨基酸
蛋白質(zhì)分子中起關(guān)鍵作用的氨基酸成分對(duì)自由基損害特別敏感，以芳香氨基酸和含硫氨基酸為突出，不同的自由基對(duì)特定氨基酸側(cè)鏈有特殊影響，如超氧陰離子介導(dǎo)甲硫氨酸氧化成為甲硫氨酸亞砜，半胱氨酸氧化成為磺基丙氨酸；羥自由基可以將脂肪族氨基酸α-位置上的一個(gè)氫原子去掉；烷氧自由基和過(guò)氧自由基等中間產(chǎn)物可以使色氨酸氧化為犬尿氨酸、N-甲基犬尿氨酸和五羥色氨酸。 [3] 
使肽鏈斷裂
活性氧所致蛋白質(zhì)肽鏈斷裂方式有2 種，一種是肽鏈水解，另一種是從α-碳原子處直接斷裂，究竟以何種方式斷裂取決于活性氧和蛋白質(zhì)的類(lèi)型、濃度和二者之間的反應(yīng)速率。肽鍵的水解常發(fā)生在脯氨酸處，其機(jī)制為活性氧攻擊脯氨酸使之引入羰基而生成α-吡咯烷酮，經(jīng)水解與其相鄰的氨基酸斷開(kāi)，α-吡咯烷酮成為新的N-末端，可以進(jìn)一步水解成為谷氨酰胺。肽鏈直接斷裂的方式是活性氧攻擊α-碳原子生成α-碳過(guò)氧基，后者轉(zhuǎn)化為亞氨基肽，經(jīng)過(guò)弱酸水解為氨基酸和雙羧基化合物。 [3] 
形成蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合物
多種機(jī)制可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)的交聯(lián)和聚合。蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸可以形成二酪氨酸，半胱氨酸氧化形成二硫鍵，兩者均可以形成蛋白質(zhì)的交聯(lián)。交聯(lián)可以分為分子內(nèi)交聯(lián)和分子間交聯(lián)2 種形式。蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和半胱氨酸的數(shù)目可以決定交聯(lián)的形式。另外，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的丙二醛（MDA）與蛋白質(zhì)氨基酸殘基反應(yīng)生成烯胺，也可以造成蛋白質(zhì)交聯(lián)。生物體內(nèi)單糖自動(dòng)氧化的α-羰醛產(chǎn)物可以與蛋白質(zhì)交聯(lián)而使酶失活，并使膜變形性下降，導(dǎo)致細(xì)胞衰老與死亡。 [3] 
改變構(gòu)像
蛋白質(zhì)經(jīng)氧化后，熱動(dòng)力學(xué)上不穩(wěn)定，部分三級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，失去原有構(gòu)像。用H2O2和抗壞血酸-Fe（III）氧化SOD，其紫外吸收增強(qiáng)，內(nèi)源性熒光減弱，表明酶分子由緊密有序排列趨于松散無(wú)序。用自旋標(biāo)記研究，探測(cè)到較低濃度抗壞血酸-Fe（III）和H2O2，就可以影響到SOD 分子亞基締合或其周?chē)慕Y(jié)構(gòu)。
改變免疫原性
用H2O2，或H2O2，-Cu2+和抗壞血酸-Fe（III）體系作用于牛紅細(xì)胞銅鋅超氧化物歧化酶（SOD）， 人血清白蛋白（HAS） 和人IgG， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOD、HAS 和IgG 與其抗體反應(yīng)增強(qiáng)， 提示活性氧可能參與了某些自身免疫性疾病中抗原抗體復(fù)合物的形成過(guò)程。 [3] 
對(duì)生物膜的損傷
自由基對(duì)生物膜的損傷是作用于細(xì)胞膜及亞細(xì)胞器膜上的多不飽和脂肪酸，使其發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，脂質(zhì)過(guò)氧化的中間產(chǎn)物脂自由基（L·）、脂氧自由基（LO·）、脂過(guò)氧自由基（LOO·）可以與膜蛋白發(fā)生攫氫反應(yīng)生成蛋白質(zhì)自由基，使蛋白質(zhì)發(fā)生聚合和交聯(lián)。另外，脂質(zhì)過(guò)氧化的羰基產(chǎn)物（如丙二醛）也可攻擊膜蛋白分子的氨基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)和分子間交聯(lián)。另一方面自由基也可直接與膜上的酶或與受體共價(jià)結(jié)合。這些氧化損傷破壞了鑲嵌于膜系統(tǒng)上的許多酶和受體、離子通道的空間構(gòu)型，使膜的完整性被破壞、膜流動(dòng)性下降，膜脆性增加，細(xì)胞內(nèi)外或細(xì)胞器內(nèi)外物質(zhì)和信息交換障礙，影響膜的功能與抗原特異性，導(dǎo)致廣泛性損傷和病變。機(jī)體中HO·大部分在細(xì)胞器中產(chǎn)生，特別是在線粒體中產(chǎn)生，造成線粒體膜的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞和機(jī)體的能量代謝障礙。 [3] 
測(cè)定方法編輯
化學(xué)反應(yīng)法
由于活性氧具有較高的反應(yīng)活性, 它們可以與許多不同的化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng), 由此產(chǎn)生各種不同的反應(yīng)生成物, 根據(jù)這些反應(yīng)生成物或者反應(yīng)物的變化程度可以進(jìn)行定量或者定性分析。通常采用的儀器分析方法有, 化學(xué)發(fā)光法 、紫外-可見(jiàn)吸收分光光度法 、熒光光度法 、電子自旋探針 以及選擇性電極法等。化學(xué)反應(yīng)法的特點(diǎn)是測(cè)定靈敏度高、廉價(jià)、操作簡(jiǎn)便等。但是, 化學(xué)反應(yīng)法的特異性相對(duì)比較差, 一些氧化還原反應(yīng)或者酶催化反應(yīng)往往對(duì)測(cè)定結(jié)果的判斷產(chǎn)生影響, 一般需要其他分析方法作為比較, 才能獲得滿意的結(jié)論。 [2] 
化學(xué)發(fā)光法
化學(xué)發(fā)光測(cè)定法是儀器分析中靈敏度高的方法之一, 已在醫(yī)學(xué)、環(huán)境以及工業(yè)分析等許多領(lǐng)域里得到廣泛的應(yīng)用 。活性氧的化學(xué)發(fā)光研究也是活性氧測(cè)定法研究領(lǐng)域中比較活躍的分支之一, 特別是針對(duì)H2O2 測(cè)定, 有許多靈敏度高、選擇性好的化學(xué)發(fā)光體系 。進(jìn)年來(lái), 筆者在H2O2 測(cè)定方面開(kāi)發(fā)了一系列高靈敏度的化學(xué)發(fā)光分析法。除此之外, 目前比較成功的活性氧化學(xué)發(fā)光測(cè)定法主要有魯米諾法(luminol)、光澤精法(lucigenin)和cypridina luciferin analog(CLA)法。
分光光度法
活性氧的分光光度測(cè)定, 常用的方法有細(xì)胞色素丙(cytochrome C)的超氧自由基還原法 和硝基四氮唑籃(nitro blue tetrazolium ,NBT)還原法 。具有氧化活性的細(xì)胞色素C 被·O-2 還原后, 形成了在波長(zhǎng)550 nm 處有強(qiáng)吸收的亞鐵細(xì)胞色素 , 可以用于O-2 的直接測(cè)定, 在SOD 存在下,O-2 受到SOD 的催化形成H2O2 和O2 , 以被開(kāi)發(fā)為SOD 的間接定量分析法 。 [2] 
但是, 活性氧的細(xì)胞色素丙還原法存在著其它還原性物質(zhì), 如HADPA 和還原性酶的干擾, 一般情況下無(wú)法直接用于O-2 的定性分析, 需要比較在SOD 的存在下, 是否還有O-2 與細(xì)胞色素丙發(fā)生反應(yīng)的結(jié)果, 從而判斷O-2 的生成與否。
熒光光度法
與化學(xué)發(fā)光一樣, 熒光分光光光度法也是靈敏度高, 操作簡(jiǎn)便的分析方法之一。比較典型的例子是, 二氯熒光素(DCFH)在過(guò)氧化物酶存在下, 被H2O2 或者HO-2 氧化形成具有有螢光的DCF , 可以有效地應(yīng)用于H2O2 定量分析[ 23] 。利用2 , 3-二氨基萘(DAN)與NO-2 在酸性條件下發(fā)生反應(yīng), 形成熒光性的1-(H)-萘三氮茂環(huán), 有人提出用2 , 3-二氨基萘(DAN)作為NO 的測(cè)定方法。 [2] 
電子自旋共振法
電子自旋共振法（ESR法） 作為活性氧的化學(xué)反應(yīng)后的檢測(cè)方法, 可以理解成是一種自由基的標(biāo)識(shí)反應(yīng), 即向活性氧生成的反應(yīng)體系中添加本身帶有不對(duì)稱(chēng)電子的自由基, 這一添加物與活性氧發(fā)生反應(yīng)后失去不對(duì)稱(chēng)電子, 從而導(dǎo)致ESR 信號(hào)的變化。