細胞內氧化應激活性氧單線態氧氣比色法定量檢測試劑盒產品說明書
主要用途
細胞內氧化應激活性氧單線態氧氣比色法定量檢測試劑是一種旨在通過二甲基-4-亞硝基苯胺，受到單線態
氧氣-的作用，出現去色現象，由分光光度儀比色分析，定量檢測細胞內單線態氧氣活性氧族的生成和增加
的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰
老、代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，檢測敏感。
技術背景
超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基
（hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧
自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）
次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等
細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。其中單線態氧
氣（singlet oxygen；1 O2）是分子氧（O2）的抗磁形式或電激發形式。通過染料分子，例如孟加拉紅（Rose
Bengal）、亞甲基蘭（Methylene Blue）、卟啉類化合物（Porphyrins）染料的光敏過程中能量轉移產生，或過
氧化氫和次氯酸的化學反應產生。單線態氧氣可以調節紫外線A輻射的生物學作用、激活各種細胞信號通
路等。單線態氧氣會導致植物的光動力損傷（photodynamic damage）和動物心血管問題?；诙谆?4-亞
硝基苯胺（N,N-Dimethyl-p-nitrosoaniline；PNDA或RNO）作為單線態氧氣的選擇性受體，在單線態氧氣的
存在下，產生去色作用，在分光光度儀下（440nm波長），呈現吸光峰值的降低。據此定量檢測細胞內單線
態氧氣活性氧族的濃度。
產品內容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
反應液（Reagent D） 毫升
陰性液（Reagent E） 毫升
產品說明書1 份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；反應液（Reagent D）避免光照；有
效保證6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
細胞刮脫棒：用于細胞脫離
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
培養箱：用于反應孵育
比色皿或酶標板：用于比色分析的容器
分光光度儀或酶標儀：用于比色分析
實驗步驟
一、樣品準備
1. 準備好25cm2 細胞培養瓶或60mm 細胞培養皿的待測培養細胞（1 至5 X 106 細胞）
2. 小心加入xx 毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
5. 加入xx 毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
6. 移入到預冷的15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7. 放進4℃臺式離心機離心5 分鐘，速度為300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx 微升裂解液（Reagent B），充分混勻
10. 轉移到預冷的1.5 毫升離心管
1． 強力渦旋震蕩15 秒
11. 置于冰槽里孵育30 分鐘
12. 放進4℃微型臺式離心機離心15 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13. 小心移取500 微升上清液到新的預冷的1.5 毫升離心管
14. 移取10 微升進行蛋白定量檢測
15. 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
二、測定準備
1． 開啟并設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長440nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應液（Reagent D）避免光照
三、背景對照測定
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx 微升陰性液（Reagent E）
3． 加入xx 微升反應液（Reagent D）
4． 上下傾倒數次，混勻
5． 在30℃溫度下孵育40 分鐘
6． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照
四、樣品測定
1． 移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入100 微升待測樣品（50 微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
3． 加入xx 微升反應液（Reagent D）
4． 上下傾倒數次，混勻
5． 在30℃溫度下孵育40 分鐘
6． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數
五、計算樣品濃度
[（樣品讀數－背景讀數）X 1 （體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數]÷[0.1（樣品容量；毫升）X 34.4（毫摩
爾吸光系數）]＝微摩爾1 O2/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾1 O2/毫克
六、酶標板測定
1． 在96 孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
2． 分別移取xx 微升緩沖液（Reagent C）到96 孔板的所有孔中
3． 分別加入xx 微升陰性液（Reagent E）或待測樣品（20 微克蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
4． 分別加入xx 微升反應液（Reagent D）到96 孔板的所有孔中
5． 輕輕搖動96 孔酶標板
6． 在30℃溫度下孵育40 分鐘
7． 即刻放進酶標儀檢測：獲得吸光讀數
8． 濃度計算：
[（樣品讀數－背景讀數）X 0.25 （體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數]÷[0.025（樣品容量；毫升）X 34.4
（毫摩爾吸光系數）X 0.6（厘米）]＝微摩爾1 O2/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝微摩爾1 O2/毫克
注意事項
1． 本產品為20 次（比色皿）或80 次（酶標板）操作
2． 避免使用*處理樣品
3． 操作時，須戴手套
4． 孵育時，避免光照
5． 系統操作過程中，背景測定只需1 次
6． 建議使用比色皿測定
7． 樣品須澄清，至關重要
8． 測定值由高到低變化
9． 比色測定后，比色皿須清洗*
10．建議待測樣本蛋白濃度為50 微克/100 微升；如果樣本濃度過低或過高， 則可以增加或降低樣本量
11．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
12．可以使用單線態氧氣抑制劑或清除劑（scavenger），即NaN3 和DABCO 作為抑制劑對照或陰性對照
13．可以使用單線態氧氣激發劑（generator），即萘啶酮酸（Nalidixic acid）等作為陽性對照
14．本公司提供系列活性氧檢測試劑產品
質量標準
1． 本產品經鑒定性能穩定
2． 本產品經鑒定檢測敏感